基于LC-MS/MS分析不同蛋白酶酶解奶牛胎盘产物差异及其抗氧化活性预测

为探究胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盘产物间差异,用此3种酶在最优条件下酶解奶牛胎盘获得胎盘酶解产物,每种酶重复3次,利用LC-MS/M技术鉴定产物中蛋白和肽段,BIO-PEP数据库匹配和测算十肽及以下的抗氧化活性多肽。结果显示:胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产物分别鉴定出541、137和86种蛋白,2 766、1 170和128个肽段,胰蛋白酶鉴定蛋白和肽段数极显著高于其余2种酶(P<0.01),木瓜蛋白酶鉴定蛋白和肽段数均显著低于其余2种酶(P<0.05);3种酶酶解产物十肽及以下具有潜在抗氧化能力肽段分别占十肽及以下肽段总量的39.14%(256/654)、32.80%(81/247)和53.33%(16/30),木瓜蛋白酶占比显著高于其余2种酶(P<0.05);胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶3种酶酶解产物抗氧化多肽共同特征是分别含有EL、LY、MM、LK、IR、MY、VY残基,HL、LK、TY、HH、EL残基和LK、IR、EL等残基。综上,通过LC-MS/M技术对酶解产物定性和定量分析,胰蛋白酶酶解奶牛胎盘的产物生物学信息最丰富,在蛋白组学中可靠性和准确性最高;木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盘最彻底,其产物潜在抗氧化活性最强,本研究为使用蛋白组学研究奶牛胎盘时酶的选择和奶牛胎盘抗氧化活性多肽的开发利用提供理论依据。     

北极海参不同酶解多肽的抗氧化活性与高效液相色谱分析

利用5种蛋白酶酶解北极海参蛋白得到5种多肽,通过化学方法检测5种多肽的体外抗氧化活性,结果表明,5种酶解多肽的体外抗氧化能力均随多肽浓度的增加而提高,对羟自由基(·OH)清除能力大小顺序为木瓜蛋白酶酶解多肽PAP胰蛋白酶酶解多肽TP≈酸性蛋白酶酶解多肽AP中性蛋白酶酶解多肽NP胃蛋白酶酶解多肽PP,对超氧阴离子(O_2~-·)清除能力大小顺序为胰蛋白酶酶解多肽TP酸性蛋白酶酶解多肽AP中性蛋白酶酶解多肽NP木瓜蛋白酶酶解多肽PAP胃蛋白酶酶解多肽PP,还原能力强弱顺序为酸性蛋白酶酶解多肽AP中性蛋白酶酶解多肽NP胰蛋白酶酶解多肽TP胃蛋白酶酶解多肽PP木瓜蛋白酶酶解多肽PAP。利用高效液相色谱分析酶解多肽的分子量分布,PP、PAP分别集中在8~20、20~14 ku,NP和TP小于7 ku的含量较高,AP一部分在20~7 ku,另一部分在7~3 ku。     

罗非鱼肉蛋白酶解液及其超滤液 的抗氧化活性研究

通过研究罗非鱼肉蛋白酶解液及其5 ku超滤液的体外抗氧化活性,为罗非鱼深加工及高值化利用提供理论基础。主要采用分光光度法分别检测了酶解液和超滤液的还原力,对·OH、O2-·、DPPH·自由基的清除能力以及在亚油酸体系中抗氧化能力并对其抗氧化活性的差异性进行分析讨论。结果发现,当浓度为1.25~2.5 mg/m L时,超滤液的还原力、在亚油酸体系中抗氧化能力低于酶解液,当浓度为2.5~10.0 mg/m L时,超滤液活性强于酶解液;以IC50计算,超滤液对自由基清除能力均优于酶解液;超滤液中亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、组氨酸和酪氨酸的含量均高于酶解液,其分子量小于3 ku与1 ku组分的比例也高于酶解液。罗非鱼肉蛋白酶解液经5 ku超滤处理后,其体外抗氧化活性增强。     

沙蚕不同酶解产物抗氧化效果研究

海洋生物蛋白资源是海洋生物资源的重要组成部分，对其进行高值化加工利用是海洋生物技术研究的重要内容，酶解是提高海洋蛋白功能性的有效方式，但酶种类不同,其作用位点不同，可能对酶解产物的活性有一定影响。为了探究了沙蚕不同酶解产物的抗氧化性，采用6种蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶）酶解沙蚕，测定了不同酶解时间下的水解度、分子量分布、3种自由基（DPPH、O-2·、·OH）的清除率等反映抗氧化水平的指标。结果表明：胰蛋白酶小分子肽得率最高，为70.47%；胃蛋白酶次之，为68.12%。酶解液浓度为5 mg·mL-1时，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解4 h时，DPPH清除率效果较好，分别为90.87%和90.52%。胃蛋白酶酶解3 h时，O-2·清除率效果最佳，为89.78%；木瓜蛋白酶酶解3 h时，O-2·清除率效果次之，为57.99%。碱性蛋白酶酶解4 h和胃蛋白酶酶解2 h时，·OH清除率效果较好，分别为85.07%和83.37%。胰蛋白酶和胃蛋白酶对提高酶解液水解度和小肽生成作用明显，胃蛋白酶的酶解产物对3种自由基清除率较好，更适用于制备沙蚕抗氧化肽。     

三种酶制备牡蛎蛋白水解物的抗氧化活性和功能特性分析

目的：比较分析木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶三种不同酶水解牡蛎获得的蛋白产物抗氧化活性和功能特性。方法：采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶三种不同酶水解牡蛎蛋白获得水解物,并分别测定它们的在不同pH下的溶解度、乳化性以及不同浓度水解物的还原能力、DPPH自由基清除率和Fe^{2 +}螯合能力。结果：表明三种酶水解物都有较高的溶解度(p＜0.01),胰蛋白酶产生的水解物溶解高度达94.8％(p＜0.05)；水解物溶解度和乳化活性指数在pH4显著降低(p＜0.05)。牡蛎蛋白质水解产物的还原能力、DPPH自由基清除能力和金属螯合活性随浓度的增加而增强,其中胰蛋白酶和胃蛋白酶抗氧化能力较强(p＜0.01)。结论：三种蛋白酶水解牡蛎蛋白可获得抗氧化活性强、溶解度高的水解物,并受浓度和pH的影响,它们的水解物可作为一种潜在的抗氧化功能多肽利用。     

藏香猪血液中抗氧化肽的提取

藏香猪是一种生长在高原上的具有独特特性的本土猪种,具有抗氧化应激能力强的特点。本研究使用超声波辅助复合酶酶解的方法处理藏香猪血液总蛋白,利用超滤离心得到具有高活性的酶解产物组分。研究表明,使用复合酶(胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶∶胰凝乳蛋白酶,1∶1∶1)按照50 U/100 mL的添加量处理猪血总蛋白6 h可使酶解产物的水解度达到最大,约为23.6%,此时酶解产物的DHHP清除能力最高,约为63.4%。短时低功率的超声波辅助处理可使酶解产物的DHHP清除能力提升至71.3%。80%以上的具有DHHP清除能力的酶解产物集中在小于1 KDa的小肽中。本研究使用的超声波辅助复合酶酶解法适用于藏香猪血液中抗氧化肽的提取。对比藏香猪和长白猪血液酶解产物的水解度和抗氧化活性,发现二者水解度相当,但是藏香猪血液的酶解产物对DHHP的清除能力比长白猪高20%左右。     

胰蛋白酶制备乌贼缠卵腺抗氧化活性多肽的研究

[目的]探讨胰蛋白酶制备乌贼缠卵腺抗氧化活性多肽的工艺及体外抗氧化活性.[方法]以乌贼缠卵腺为原料,用胰蛋白酶进行酶解,采用单因素和正交试验优化乌贼缠卵腺抗氧化活性肽的提取工艺;将酶解液超滤分成4个分子段,通过体外检测DPPH清除率、·OH清除率和还原力评价其抗氧化活性.[结果]胰蛋白酶酶解乌贼缠卵腺在加酶量2000 U/g、pH为8.5、料液比1:3、酶解时间8 h条件下得到的酶解物对DPPH的清除率最大.酶解液经超滤得到的<3 kD分子段的多肽具有良好的DPPH清除能力、·OH清除能力和还原能力.[结论]胰蛋白酶酶解制备的乌贼缠卵腺多肽具有较好的体外抗氧化活性,可作为抗氧化肽的理想来源.     

酶解奶油增香物的制备工艺及应用

通过对3种不同脂肪酶酶解奶油制备奶油增香物,筛选出最佳的试验用酶Palatase 20000L。研究表明,Palatase 20000L酶解奶油增香物的最佳工艺条件温度为40℃,酶解时间为6 h,pH 6.5,底物浓度50%,酶添加量2%;利用此工艺条件制备的酶解奶油增香物10%加入到饲料奶香产品中,使产品奶香更加柔和,延长了产品的留香能力,增强了适口性。     

混酶水解法制备的鲢鱼皮多肽的抗氧化活性

以鲢鱼皮为原料,采用混酶水解法制备鲢鱼皮抗氧化肽,经超滤膜分离得到SP1(6 ku)、SP2(3～6 ku)、SP3(3 ku)3种组分,研究不同分子质量组分的体外抗氧化能力及SP1和SP3组分的氨基酸组成,并选出体外抗氧化能力最强的SP3组分,进行体内抗氧化活性评价。结果表明:3种组分的羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和还原能力从高到低的顺序均为SP3SP2SP1,而铜离子螯合率无显著差异;氨基酸分析结果显示SP3组分中疏水性氨基酸所占比例较高;体内抗氧化试验显示:相较于损伤模型组,灌服SP3组分的小鼠肝脏和脾脏指数明显增大,且血清和肝脏中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的酶活力明显提高,丙二醛(MDA)含量明显降低。综上可知,SP3组分在体内外均具有较好的抗氧化活性。     

鲍内脏抗氧化活性肽制备工艺研究

为建立鲍内脏抗氧化活性肽制备工艺,在单因素试验基础上,利用响应面法优化酶解工艺条件,建立了酶解时间、酶添加量、酶解温度与DPPH自由基清除率之间的数学模型;经超滤分离获得了不同分子质量的酶解产物,采用DPPH自由基和超氧阴离子自由基(O_2~-·)的清除能力评价其抗氧化性,经MALDI-TOF/TOF分析其分子质量分布。结果表明:酶法提取鲍内脏抗氧化肽的最佳工艺为料液比1∶1、酶解时间4.8h、酶添加量3 000U·g~(-1)、酶解温度54℃;获得的分子质量为2~6ku的组分具有较强的自由基清除能力,DPPH自由基和O-2·清除能力分别为94.76%和60.24%。     

酶制备牡蛎蛋白水解物的抗氧化活性和功能特性分析

为比较分析木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶3种不同酶水解牡蛎获得的蛋白产物抗氧化活性和功能特性,本文采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶3种不同酶水解牡蛎蛋白获得水解物,并分别测定它们在不同pH值下的溶解度、乳化性以及不同浓度水解物的还原能力、DPPH自由基清除率和Fe~(2+)螯合能力。结果表明,3种酶水解物都有较高的溶解度(P0.01),胰蛋白酶产生的水解物溶解度最高,94.8%(P0.05);水解物溶解度和乳化活性指数在pH值为4时显著降低(P0.05)。牡蛎蛋白质水解产物的还原能力、DPPH自由基清除能力和金属螯合活性随浓度的增加而增强,其中胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解物抗氧化能力较强(P0.01)。3种蛋白酶水解牡蛎蛋白可获得抗氧化活性强、溶解度高的水解物,并受浓度和pH值的影响,它们的水解物可作为一种潜在的抗氧化功能多肽利用。     

植物蛋白质酶解产物超滤分析及对成纤维细胞生长的影响

用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和A s1.398枯草蛋白酶分别对豆粕、棉粕、菜粕和花生粕的蛋白质进行酶解,并对其酶解产物进行超滤分析及用产物对小鼠胚胎成纤维细胞进行培养试验,探讨不同蛋白酶解产物的蛋白质组成及对细胞生长的影响。结果表明:酶解产物中蛋白质分子质量分布与酶的种类和植物蛋白质种类有关,其中A s1.398枯草蛋白酶对豆粕酶解能力最强,酶解产物中蛋白质分子质量小于3 ku的比例占31.67%;各酶解产物对小鼠胚胎成纤维细胞生长都有促进作用,以A s1.398枯草蛋白酶酶解的棉粕产物对小鼠胚胎成纤维细胞生长的促进作用最好,其细胞生长速度比豆粕、菜粕和花生粕酶解产物组显著提高。     

胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺的优化

采用胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白(MRJPs),对底物浓度、pH值、酶作用时间和蛋白酶浓度对水解效果的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对胃-胰蛋白酶共同作用的酶解工艺进行优化;最后采用超滤分离技术对王浆主蛋白水解产物(H-MRJPs)进行分离,以制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。结果表明:优化的酶解工艺为37℃恒温、质量比为1%的胃蛋白酶(pH=2.0)和胰蛋白酶(pH=7.5)各水解2h;在最佳工艺条件下,MRJPs水解度为28.7%,总氮回收率为35.5%;通过SDS-PAGE电泳未检测到MRJPs水解产物(H-MRJPs)含有明显的蛋白条带;采用超滤法对H-MRJPs分离得到分子质量范围为<1、1～5和>5ku的3类血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,其ACE半抑制质量浓度(IC50)分别为0.33、0.61和1.09mg.mL-1,即以分子质量<1ku的产物活性最强。该结果为利用王浆主蛋白开发降压功能食品提供了科学依据。     

猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的抗氧化活性研究

以猪骨蛋白酶解液和葡萄糖（或木糖）为原料,100 ℃水浴加热120 min以制备美拉德反应产物,采用超滤分离产物获得不同分子量范围（<1、1～5、5～10、>10 ku）的组分,研究各分离组分的体外抗氧化活性。结果表明,不同组分均具有一定的抗氧化活性,其中分子量>10 ku的组分具有较高的DPPH自由基清除能力、还原能力以及Fe2+螯合活性,表明高分子量美拉德反应产物的抗氧化能力更强。葡萄糖、木糖组产物的自由基清除能力、还原能力以及Fe2+螯合活性差异均不显著（P＞005）,说明还原糖结构对该研究制备的美拉德反应产物的抗氧化活性未产生明显影响。     

大西洋鳕鱼皮多肽体外抗氧化活性研究

[目的]探讨大西洋鳕鱼皮多肽的体外抗氧化活性。[方法]选择胰蛋白酶酶解鳕鱼皮,分别以氨基氮滴定法和DPPH自由基清除率作为筛选指标,通过正交试验,筛选出酶解的最优条件;将超滤液分成5段,分别进行DPPH自由基清除率、ABTS自由基力及亚铁离子螯合能力的体外抗氧化活性。[结果]胰蛋白酶酶解大西洋鳕鱼皮的最优条件为料液比1∶1,加酶量2 500 U/g、酶解时间4 h、温度45℃、pH 9.0。当分子量小于5 k D时,DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和Fe2+离子螯合能力最强。[结论]经胰蛋白酶酶解,获得的大西洋鳕鱼皮多肽存在较好的抗氧化活性。     

从麦胚清蛋白分离制备高活性抗氧化肽

【目的】探究能有效地从小麦胚芽清蛋白二步双酶酶解物中分离得到高活性抗氧化肽的工艺。【方法】以小麦胚芽清蛋白为原料,DPPH自由基清除率和Fe²⁺螯合能力为抗氧化活性的评价指标,通过胰蛋白酶进行酶解,依次采用超滤膜和凝胶过滤色谱（Sephadex G-75）对酶解产物进行分离纯化,筛选出活性较高的组分;采用碱性蛋白酶对获得的活性较高组分进行酶解,通过凝胶过滤色谱（Sephadex G-15）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化其酶解产物;采用质谱技术（ESI-TOF MS/MS）对抗氧化活性最高的组分进行结构鉴定。【结果】分离得到3个活性组分（峰）P_a、P_b、P_c,采用DPPH法和Fe²⁺螯合能力测定法测定其抗氧化活性的结果都显示,在3个组分中,提取率为23.1%的组分P_b抗氧化活性最强（P＜0.05）,因此选取组分P_b进行下一步碱性蛋白酶酶解。该酶解物经Sephadex G-15分离后得到P_d和P_e两个组分（峰）,经抗氧化活性测定,选取提取率为52.1%的高抗氧化活性组分P_d（P＜0.05）进一步通过RP-HPLC进行疏水性分离,得到P₁、P₂、P₃、P₄、P₅五个活性组分（峰）,其中提取率为7.3%的组分P₃的抗氧化活性最强（P＜0.05）,其DPPH自由基清除率和Fe²⁺螯合能力的EC₅₀值分别为1 mg·mL^-1、0.6 mg·mL^-1。最后通过质谱技术（ESI-TOF MS/MS）鉴定组分P₃的结构,得到其氨基酸序列为AREGETVVPG,分子量为1 013.51 Da,纯度约为85%,与用化学方法合成的多肽AREGETVVPG（纯度95%以上）的抗氧化活性相比,结果没有显著差异（P>0.05）。【结论】二步双酶酶解结合超滤膜、凝胶过滤色谱和RP-HPLC等蛋白分离纯化技术为直接得到单一的高活性抗氧化肽提供了技术参考。     

草鱼鳞酶解物的制备及其促嗜热链球菌生长作用

为提高水产品综合利用率和开发新型益生菌功能性食品,以鱼类加工副产物草鱼鳞为研究对象,利用风味蛋白酶对其进行酶解,并以酶解物促嗜热链球菌增殖作用为评价指标,结合单因素试验与响应面Box-Benhnken中心组合试验优化酶解工艺,得到最优酶解条件：酶解时间3.8 h,料液比（w/v） 1∶3.2 g/mL,加酶量6.2%。在此条件下,嗜热链球菌增殖量ΔOD₆₀₀=1.173 4 ±0.015 0。同时,将最优酶解条件下得到的酶解物进行膜过滤分离,得到分子量<1 ku、1~<3 ku、3~<5 ku、5~<10 ku、≥10 ku的5个组分,并进一步就各组分对嗜热链球菌的生长曲线和产酸能力的影响进行研究。结果表明,在嗜热链球菌24 h的生长曲线中,分子量<1 ku的组分促嗜热链球菌生产和产酸效果最好：嗜热链球菌增殖量ΔOD₆₀₀为1.050,培养基的pH比初始值降低了1.06。     

北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备

为探讨北太平洋鱿鱼(Todarodes pacificus)缠卵腺酶解寡肽的制备和抗氧化活性,以北太平洋鱿鱼缠卵腺为原料,选择碱性蛋白酶进行酶解,以水解度和DPPH自由基清除率为指标,经单因素和正交试验方法获得最佳酶解条件,超滤得到不同分子段多肽,通过测定还原能力、DPPH清除率、Fe~(2+)螯合能力、OH自由基清除率、超氧阴离子清除率评价不同分子量酶解多肽的抗氧化性,得出最佳分子段;采用琼脂糖凝胶G-25对最佳分子段进行分离,检测各峰对DPPH清除能力,得出最佳峰段后经HPLC进一步分离获得单一组分,由氨基酸测序仪进行N端降解测序得出目标肽序列。结果表明,碱性蛋白酶的酶解条件为温度50℃、酶解时间7 h、加酶量3 500 U/g、pH 9.0、料液比1∶6。经超滤得到的3～5 ku分子段抗氧化活性最强,经琼脂糖凝胶G-25分离得到3个峰,其中峰Ⅰ组分对DPPH清除率最好,当浓度为0.5 mg/m L时其DPPH的清除率为61.87%。经HPLC纯化得到单一峰,氨基酸序列测定为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser,相对分子质量为497.50。北太平洋鱿鱼缠卵腺酶解寡肽有较好的抗氧化活性。     

龙须菜蛋白质的提取及其酶解产物的抗氧化特性

以干燥后的龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)粉为原料,采用超声辅助碱提酸沉法提取龙须菜蛋白质。首先通过单因素实验选择了影响龙须菜蛋白质提取率的因素及水平范围,然后以Box-Behnken中心组合设计原理建立二次响应面回归模型,确定了最佳提取条件为:碱浓度0.2 mol·L^-1、液固比24:1 (mL·g^-1)、超声时间70 min、超声功率482 W,在此条件下的龙须菜蛋白质提取率为73.78%。此外,对提取得到的龙须菜蛋白质进行了酶解,分别研究了木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、植物蛋白复合酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶对酶解产物抗氧化活性和分子量的影响。结果表明,在酶解4 h后,碱性蛋白酶酶解产物的抗氧化活性显著高于其他4种酶酶解产物和龙须菜蛋白质,其铁离子还原能力(ferric reducing antioxidant power, FRAP)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除率和2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除率分别为81.88 μg·mL^-1、63.29%、64.25%,分子量主要集中在1 500 u以下。本研究可为龙须菜蛋白质的提取及其高值化利用提供一定参考。     

传统与现代工艺金华火腿蛋白质的体外消化特性研究

[目的]比较传统与现代2种加工工艺条件下金华火腿蛋白质的消化特性。[方法]以传统工艺和现代工艺的金华火腿为材料,通过体外模拟胃肠道消化反应,样品经过匀浆、胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后,测定蛋白质消化率和匀浆物粒径,并进行SDS-PAGE分析,运用LC-MS/MS分析消化产物。[结果]经胃蛋白酶和/或胰蛋白酶消化后,现代工艺火腿的消化率显著高于传统工艺(P0.05)。酶解消化前后,现代工艺火腿的粒径值要显著小于传统工艺。SDS-PAGE凝胶条带分析结果显示:未经消化的样品条带中,传统工艺火腿的大部分蛋白条带光密度显著高于现代工艺,而经过胃蛋白酶消化后,大部分高分子质量条带消失,只有小分子质量条带在凝胶底部被采集。LC-MS/MS分析表明:传统工艺火腿蛋白质酶解产物含有的相对分子质量为1 500~2 500的肽段多于现代工艺,并且2种工艺下的火腿蛋白酶解产物大多来自于肌原纤维蛋白,尤其是肌球蛋白。[结论]现代工艺火腿的蛋白质消化特性优于传统工艺。