黑曲霉GAⅠ基因的克隆及在P.pastoris中的分泌表达

采用RT-PCR技术,从黑曲霉的菌丝体RNA中扩增出葡萄糖淀粉酶GAI的结构基因,将其连接到pPICZαA载体中,转入巴斯德毕赤酵母GS115中,获得8株重组酵母;甲醇诱导目的蛋白分泌表达,葡萄糖淀粉酶酶活最高达174 U/mL,占上清液蛋白的36%.     

葡萄糖与酵母膏配比对猴头菌胞外酶活性的影响

为揭示碳源和氮源配比对猴头菌胞外酶活性的影响,选用葡萄糖作为碳源,酵母膏作为氮源,以猴头菌(Hericium erinaceus)菌种RT22为材料,基础培养基中葡萄糖与酵母膏配比为3∶1为对照,设置基础培养基中葡萄糖和酵母膏配制比例为5∶3、2∶1、7∶3、5∶2、7∶2、5∶1、6∶1、7∶1的液体培养基,摇床培养8 d后,取猴头菌菌液测定羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、滤纸纤维素酶、漆酶、过氧化物酶的活性。结果表明:在葡萄糖和酵母膏配制比中,羧甲基纤维素酶活性、半纤维素酶活性、淀粉酶活性、漆酶活性在葡萄糖和酵母膏配比为2∶1处理下最强;滤纸纤维素酶活性在葡萄糖和酵母膏配比为7∶2处理下最强;过氧化物酶活性在葡萄糖和酵母膏配比为7∶1处理下最强,其中葡萄糖和酵母膏配比为2∶1处理与配比为7∶2处理的滤纸纤维素酶活性差异不显著。在选用葡萄糖作为碳源、酵母膏为氮源时,基础培养基中碳源和氮源最适配比为2∶1,是适合猴头菌生长的最适碳氮配比。     

微小根毛霉耐热α-淀粉酶基因的克隆与高效表达

[目的]开发具有高表达活力的耐热耐酸新型真菌α-淀粉酶,研究其酶学性质和催化活性,探讨其潜在工业应用潜力.[方法]采用RT-PCR从嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆耐热α-淀粉酶基因,并命名为RpAmy.以质粒pPIC9K为表达载体,将α-淀粉酶基因(RpAmy)转入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达宿主KM71,进行异源表达,并测定动力学参数和酶学性质,分析水解淀粉的产物.[结果]克隆得到嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)耐热α-淀粉酶基因,其开放阅读框全长1416 bp,编码471个氨基酸,与米根毛霉α-淀粉酶的氨基酸序列相似性最高(56.0%).RpAmy在毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71中表达,最高酶活达到32100.0 U/mL,蛋白表达量为1.5 mg/mL;测定纯化后RpAmy比活力、Km和Vmax,分别为6745.9 U/mg、2.26 mg/mL、0.2875 mg/mL·min;最适pH和最适温度分别为pH 4.0、70℃;具有较宽的pH耐受性(4.0~9.0)和较高的温度耐受性(60℃);水解可溶性淀粉产物主要为麦芽糖(69.0%,w/w)和葡萄糖(22.0%,w/w).[结论]从微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆得到α-淀粉酶基因(RpAmy),其可在毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71中高效异源表达并得到α-淀粉酶RpAmy.该酶具有较好的耐酸耐热性质,并能水解淀粉产生高麦芽糖含量的糖浆,在工业应用方面具有很大的潜力.     

混合营养模式下3种有机物对蛋白核小球藻生长及细胞组成的影响

以一株新分离的蛋白核小球藻SHOU-1002(Chlorella pyrenoidosa SHOU-1002)为试验材料,设置分别添加葡萄糖、谷氨酸钠和酵母浸出物的3组混合营养组和光合自养组,比较不同营养模式下蛋白核小球藻的生长及细胞组成的差异。结果表明：在混合营养模式下接种后蛋白核小球藻细胞密度始终显著高于光合自养组(P＜0.05)。接种后6d内葡萄糖组的藻细胞密度显著高于谷氨酸钠组和酵母浸出物组(P＜0.05)；第10d起,3个混合营养组藻细胞密度无显著性差异(P＞0.05)。培养第12d,谷氨酸钠组和酵母浸出物组的叶绿素a、类胡萝卜素、蛋白和总脂含量显著高于葡萄糖组(P＜0.05),碳水化合物含量则显著低于葡萄糖组(P＜0.05)。随培养时间的延长,葡萄糖组的饱和脂肪酸(SFAs)含量不断升高,多不饱和脂肪酸(PUFAs)含量不断降低；谷氨酸钠组和酵母浸出物组的PUFAs含量则先降低后升高；培养第12d,谷氨酸钠组和酵母浸出物组的PUFAs含量显著高于葡萄糖组(P＜0.05)。表明该株蛋白核小球藻具有混合营养能力且混合营养模式下其生长效能显著提升,混合营养模式下添加酵母浸出物或谷氨酸钠所培养的藻细胞较添加葡萄糖所培养的藻细胞具有更高的营养价值。     

棉铃虫葡萄糖氧化酶HaGOX在毕赤酵母中的重组表达和性质研究

毕赤酵母是使用最广泛、最具有发展前景的异源蛋白表达系统之一。在毕赤酵母GS115中实现了来源于棉铃虫(Helicoverpa armigera)葡萄糖氧化酶基因hagox的异源表达。以棉铃虫hagox基因连接pPICZαA质粒构建重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115H菌株后得到含有hagox基因的重组酵母菌株。通过平板显色、酶活力测定和SDS-PAGE分析,重组酵母中HaGOX成功表达。HaGOX含606个氨基酸,理论分子量66.9 kD,预测等电点pH 4.78。经测试重组HaGOX的最适pH为6.0～7.0,最适温度为40℃,对6-脱氧-葡萄糖和D-葡萄糖具有高催化活力,以D-葡萄糖为底物的比活力为13.63 U·mg~(-1),对其他吡喃糖和二糖没有催化活力。     

影响酵母凝集性因素研究

对影响酵母凝集性因素的研究表明，葡萄糖比麦芽糖代谢抑制酵母凝集性的作用更强。酵母接种量增加，原发酵液中酵母凝集性增强，低接种量时凝集性增加幅度较大，再增加时，变化则较小。酒花能增强重啤酵母的凝集性。α－氨基氮含量和酵母使用代数对酵母凝集性影响不大。     

THB酵母蛋白的开发及其饲用价值

本文详细叙述了ＴＨＢ酵母蛋白的生产工艺，分析了ＴＨＢ酵母蛋白的营养成分，并通过饲养试验的结果，得出ＴＨＢ酵母蛋白的饲用价值，为开发利用酵母蛋白提供了科学依据。     

花生3-磷酸甘油酰基转移酶基因的功能鉴定

花生(Arachis hypogaea)是我国的主要油料作物,花生油脂的合成受3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)调控,但其调控机制尚不清楚。从花生中克隆了13个GPAT基因,编码含有4个酰基转移酶保守结构域的蛋白;同时,运用酵母遗传互补体系对基因功能进行了鉴定。在该体系中,酵母双突变体菌株ZAFU1(Δgat1/Δgat2)因缺少GPAT而不能在特定的葡萄糖培养基上生长。结果表明,AhGPAT1/2/3/6/9与空白载体一样,其导入并不能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷,而AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的导入能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷,说明上述3个基因具有酰基转移酶活性,从而为进一步研究花生油脂的合成代谢调控提供了参考。     

不同酵母细胞处理方法对酶法合成谷氨酰胺能量偶联体系的影响

研究了不同酵母细胞处理方法对酶法合成谷氨酰胺能量偶联体系的影响。结果表明，采用气流干燥法处理酵母细胞，体系中葡萄糖消耗量达100％，谷氨酰胺合成率接近90％。     

α-淀粉酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

以克隆自野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因质粒(pHN8004)为模板,通过PCR方法将α-淀粉酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A中,转化毕赤酵母GS115.利用甲醇对重组毕赤酵母GS115(pHBM905AM1)进行诱导,实现了表达.培养温度为28℃,用体积分数为1.0%的甲醇诱导,第7天分泌表达的α-淀粉酶酶活性最高,为1 081 U.mL-1,该酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为50℃和5.9.     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶研究进展

本文论述了黑曲霉葡萄糖淀粉酶的一般生物学特性及结构与功能的关系,重点对黑曲霉葡萄糖淀粉酶的分子生物学研究进展进行了较详细的阐述。     

淀粉粒表面蛋白和脂对水稻淀粉水解动态的影响

[目的]明确淀粉粒表面蛋白和脂对水稻淀粉水解动态的影响。[方法]利用十二烷基硫酸钠脱去淀粉粒表面蛋白和脂、α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解淀粉,测定淀粉被酶水解成葡萄糖的动态。[结果]淀粉粒表面蛋白和脂降低淀粉水解速度,这种影响在糯性淀粉中表现不明显,而在直链淀粉含量较高的淀粉中表现较显著。[结论]淀粉粒表面蛋白和脂影响淀粉水解。     

红酵母鱼法

红酵母鱼法美国加尼福尼亚利用红酵母饲喂鲑鱼，不仅使其颜色更红，且生长良好。红色的酵母体所含热量与一般酵母不同，其脂肪含量高，能发酵葡萄糖和其它糖类，产生类胡萝卜素，对提高鲢鱼肉质非常有益。（杨立华）红酵母鱼法@杨立华...     

用玉米皮制取饲料酵母

配合饲料原料中，最紧缺的是饲料蛋白，特别是动物性蛋白。开发饲料蛋白具有很高的经济和社会效益。我厂利用玉米制淀粉糖中筛分出来的玉米皮制取单细胞蛋白（主要是饲料酵母），效果较好。１玉米皮制饲料酵母工艺流程１．１玉米皮的水解将湿法加工淀粉中被筛分出来的玉米...     

蓝莓果酒发酵过程中酒精度和前花青素含量的变化

为优质蓝莓果酒生产提供技术依据,选择6组发酵剂(酵母+葡萄糖,酵母+白砂糖,葡萄糖,白砂糖,酵母+白砂糖+果胶酶,酵母+白砂糖+偏重亚硫酸钾)酿制蓝莓果酒,对其发酵过程中酒精度和前花青素的变化进行跟踪测定,探索其变化规律。结果表明:白砂糖和葡萄糖作为蓝莓果酒发酵的糖源其酒精转化程度相近,酒精生成速率白砂糖源略高于葡萄糖源;添加酵母的蓝莓果酒发酵周期短,酒精生成速率快;添加果胶酶和偏重亚硫酸钾的蓝莓果酒发酵速度快,周期短,果酒品质优。6组不同处理蓝莓果酒发酵过程中前花青素含量差异不明显,蓝莓果酒成品的前花青素含量平均为0.311g/L。     

基于pHY300PLK的分泌表达载体的构建

用PCR、酶切、连接方法将地衣芽孢杆菌耐高温α淀粉酶基因(amy)表达单元(包括启动子、信号肽及淀粉酶基因)克隆到pHY300PLK中，并用反向PCR、同源重组方法，去除重组质粒的氨芐抗性基因，以利用α淀粉酶基因的启动子和信号肽高效表达自身蛋白及外源蛋白。结果表明：连入了α淀粉酶表达单元的pHY300PLK，即pAMY质粒能够分泌表达α淀粉酶，且去除了氨苄抗性基因的pAMY质粒，即pAMY1质粒能更有效的表达α淀粉酶；将纤维素酶基因连接到pAMY1质粒中淀粉酶信号肽的下游，得到的重组质粒pCEL能分泌表达纤维素酶，表明α淀粉酶基因的启动子和信号肽不仅能启动自身蛋白的表达，也能启动外源蛋白的表达；重组菌的生长情况与质粒拷贝数的比较表明，与PAMY质粒相比去除了氨苄抗性基因的pAMY1质粒对重组菌的生长没有影响，且pAMY1质粒在重组菌的复制效率更高，能更高效的表达蛋白，以上结果证明pHY300PLK克隆质粒已成功改造成表达质粒，下一步可用于更多外源基因的分泌表达。     

甘薯IbTPS1基因的克隆与活性鉴定

[目的]发掘植物海藻糖合成途径关键酶基因,探究其编码蛋白TPS活性,为作物遗传改良抗多种胁迫提供优良的候选基因。[方法]本研究基于干旱条件下从甘薯转录组数据库中得到一条与拟南芥AtTPS1基因高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR技术克隆了甘薯TPS基因。利用生物信息学软件分析序列特征,酵母互补试验鉴定编码蛋白TPS活性。[结果]IbTPS1基因cDNA序列全长2 811bp,编码936个氨基酸,且具有典型的GT1-TPS和HAD-TPP结构域;生物信息学预测表明IbTPS1编码的蛋白是一个不稳定亲水性蛋白,无信号肽,定位于细胞质中;二级结构元件多以无规则卷曲和α-螺旋为主;酵母互补实验证明表达IbTPS1基因的TPS突变酵母菌株(tps1Δ)和TPS,TPP双突变酵母菌株(tps1Δtps2Δ),以葡萄糖为唯一碳源的尿嘧啶缺失培养基上可恢复生长。[结论]证实甘薯IbTPS1基因的编码蛋白具有生物活性。     

甜瓜果实发育相关SWEET糖转运蛋白基因的鉴定与功能初步分析

甜瓜是我国，也是世界上最重要的夏令水果之一。甜瓜果实内所含碳水化合物的种类和数量很大程度上决定其品质和产量。SWEET(sugars will eventually be exported transporters)糖转运蛋白具有运输葡萄糖和其他寡糖的功能，最近研究表明，SWEET糖转运蛋白在果实发育中可能起调控作用。本研究从甜瓜基因组中鉴定获得18个SWEETs糖转运蛋白基因，进一步通过RT-PCR并结合实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法，筛选到3个SWEETs基因在整个果实发育期内或某个发育时期表达量较高。亚细胞定位显示，两个SWEETs基因(CmSWEET3,CmSWEET7a)定位在细胞膜上。进一步通过酵母表达发现，甜瓜CmSWEET7a在体外具有转运葡萄糖和果糖的功能。本研究为揭示SWEET糖转运蛋白在甜瓜果实发育过程的调控作用奠定了基础。     

啤酒麦糟制备蛋白饲料过程中蛋白质的转化

啤酒麦糟经湿磨，稀酸预水解和酶水解后，有３７％的麦糟蛋白溶解在水解糖液中，糖液供培养酵母用，溶解在其中在麦糟蛋白质４０％～５０％能被酵母利用转化成酵母蛋白。产酶用纤维渣中保留了２０％麦糟蛋白，在产酶过程中菌丝体可溶解并利用共中３０％的麦糟蛋白质合成纤维素酶，６３％的麦糟蛋白质留在滤渣，预水解渣，酶解渣和产酶渣中，干燥后与酵母混合制成蛋白饲料。麦糟蛋白质在所选用的工艺条件下，基本不受损失。     

春小麦α-淀粉酶及抑制蛋白与穗发芽的关系

用降落值法和SDS-PAGE薄层扫描法分别测定31个春小麦品种的降落值和α-淀粉酶抑制蛋白的浓度。结果表明：小麦的降落值与穗发芽率呈极显著的负相关，小麦α-淀粉酶活性的高低是造成穗发芽的主要原因。小麦α-淀粉酶抑制蛋白的浓度与α-淀粉酶及穗发芽率无相关性，它不能抑制小麦的α-淀粉酶活性，不能影响小麦的穗发芽抗性。