秋水仙碱对猪卵母细胞成熟及MⅠ期纺锤体的影响

[目的]本试验旨在研究猪卵母细胞成熟过程中细胞骨架的动态变化以及秋水仙碱对卵母细胞成熟及MⅠ期纺锤体的影响。[方法]采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微成像技术,检测微管蛋白(α-tubulin)等细胞骨架蛋白的表达与亚细胞定位,之后采用秋水仙碱处理猪卵母细胞,研究秋水仙碱对卵母细胞成熟及MⅠ期纺锤体结构的影响。[结果]猪卵母细胞α-tubulin在生发泡破裂(GVBD)之后开始组装,第一次减数分裂中期(MⅠ)形成典型的纺锤体结构,第一次减数分裂后期至末期(ATⅠ)则分布于两组染色体之间,第二次减数分裂中期(MⅡ)在染色体附近重新组装形成典型的纺锤体;微丝蛋白(F-actin)在GVBD之后富集在细胞外周皮质下区域,并分别于MⅠ期和MⅡ期在纺锤体紧邻的皮质区富集形成微丝帽。在此基础上,通过秋水仙碱处理MⅠ期卵母细胞后,第一极体(pbⅠ)排出率显著下降,且绝大多数卵母细胞纺锤体解聚,染色体排列紊乱;但秋水仙碱撤除后,微管蛋白可重新组成MⅠ期纺锤体结构,延长培养时间后,pbⅠ排出率恢复。[结论]猪卵母细胞成熟过程中细胞骨架的动态变化具有阶段性分布特点,秋水仙碱可以使猪卵母细胞MⅠ期纺缍体发生解聚,成熟受到抑制,但秋水仙碱对MⅠ期卵母细胞纺缍体结构及功能的影响在一定程度上具有可逆性。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化

为研究猪未成熟期(GV期)和体外成熟期(MⅡ期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化,随机取新鲜与冷冻-解冻后的GV期和MⅡ期卵母细胞制备电镜标本.GV期和MⅡ卵母细胞分3组进行处理:Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为GV期卵母细胞冷冻组,Ⅲ组为MⅡ期卵母细胞冷冻组.结果表明,所用玻璃化冷冻程序更适用于猪GV期卵母细胞的冷冻保存,GV期冷冻组卵母细胞的二乙酸荧光素(FDA)染色存活率、卵裂率均明显高于MⅡ期卵母细胞冷冻组.透射电镜观察结果发现,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,主要表现为部分卵丘-卵母细胞复合体(COC)发生卵丘细胞脱落,透明带破损,卵丘细胞碎裂,卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏,卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少,卵母细胞内脂滴多呈均质状.而MⅡ期卵母细胞冷冻后,皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下,仅可见形态不规则的不均质脂滴,其周围常严重空泡化.试验表明,采用适当的冷冻方案,可以获得少量源于冷冻保存的猪GV期卵母细胞的胚胎.而猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,经体外受精未见卵裂,脂滴严重空泡化是其最为明显的变化.     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化

为研究猪未成熟期(GV期)和体外成熟期(MⅡ期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化,随机取新鲜与冷冻-解冻后的GV期和MⅡ期卵母细胞制备电镜标本.GV期和MⅡ卵母细胞分3组进行处理:Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为GV期卵母细胞冷冻组,Ⅲ组为MⅡ期卵母细胞冷冻组.结果表明,所用玻璃化冷冻程序更适用于猪GV期卵母细胞的冷冻保存,GV期冷冻组卵母细胞的二乙酸荧光素(FDA)染色存活率、卵裂率均明显高于MⅡ期卵母细胞冷冻组.透射电镜观察结果发现,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,主要表现为部分卵丘-卵母细胞复合体(COC)发生卵丘细胞脱落,透明带破损,卵丘细胞碎裂,卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏,卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少,卵母细胞内脂滴多呈均质状.而MⅡ期卵母细胞冷冻后,皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下,仅可见形态不规则的不均质脂滴,其周围常严重空泡化.试验表明,采用适当的冷冻方案,可以获得少量源于冷冻保存的猪GV期卵母细胞的胚胎.而猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,经体外受精未见卵裂,脂滴严重空泡化是其最为明显的变化.     

猪卵母细胞透明带弹性系数—杨氏模量测定

 【目的】为了探讨猪卵母细胞的生物物理特性，该文研究了猪卵母细胞透明带的力学性质。【方法】在39℃环境下，利用微管吸吮的方法在倒置显微镜下通过显微操作装置用显微玻璃管吸吮猪卵母细胞，通过自制的专用于卵母细胞透明带杨氏模量测量软件，测量了经过44～48 h体外成熟培养的核成熟和核未成熟猪卵母细胞（n=76，共7次重复）的透明带杨氏模量。【结果】计算得到猪卵母细胞透明带的弹性模量为（1.43±0.29）×104Pa。【结论】该研究结合了生殖生物学和力学的内容，为评判哺乳动物卵母细胞和胚胎质量开拓了新的思路和内容。     

猪卵母细胞冷冻保存研究

【目的】本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型，从而有效地保存猪卵母细胞;【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素（FDA）染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】（1）程序化法冷冻保存中，9%乙二醇（EG），10%二甲基亚砜（DMSO），10%甘油（Gly）均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用，极显著高于对照组（FDA染色成活率33.8%，25.8%，23.5% vs 2.5%，P <0.01），且以9%EG的效果最好，显著高于另外两组（ 33.8% vs 25.8%，23.5%, P <0.05）。（2）玻璃微细管（GMP）法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法，以普通的麦管（Straw）法进行的程序化冷冻为对照组，GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率（分别为63.3%和34.5%，P<0.05）。（3）在玻璃化冷冻方法中，不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液，Straw和GMP管作冷冻液载体，卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%，二者差异显著（P <0.05）。（4）用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著（成活率分别为30.0%和59.7%，P<0.05）。冷冻后继续培养，分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。（5）冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4.9%的受精卵分裂，极显著低于对照组的49.5%（P<0.01）；发育至4-细胞期的比例为1.7%，但未能发育至8-细胞期以上胚胎。【结论】选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞，为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。     

卵母细胞扫描电镜和透射电镜样本的制作

[目的]探讨卵母细胞扫描电镜和透射电镜的制作方法,为相关研究提供技术支持。[方法]以猪GV期和体外成熟MII期卵母细胞为研究对象,分别制作扫描电镜样本和透射样本,并观察其超微结构变化。[结果]所用方法需样本量少,电镜下细胞形态结构完好,超微结构清晰。[结论]证实该方法适用于卵母细胞超微结构观察的制样。     

小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及胚胎发育的影响

【目的】探讨小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及体外受精胚胎发育效果的影响。【方法】体外成熟液和胚胎培养液中添加小檗碱为Ber组,未添加小檗碱为对照组,MII期卵母细胞进行冷冻液处理为冷冻液处理对照组和冷冻液处理+Ber组;采用开放式拉长塑料细管法对卵母细胞玻璃化冷冻与解冻,试验各组别为GV期冷冻组、GV期冷冻+Ber组、MII期冷冻组、MII期冷冻+Ber组。观察卵母细胞体外成熟效果及其体外受精胚胎体外发育效果;观察卵母细胞冷冻化学损伤存活率及其体外受精胚胎发育率;采用尼罗红染色法观察卵母细胞中脂滴含量,观察卵母细胞玻璃化冷冻解冻后存活率及其体外受精胚胎发育率;利用差异染色法和TUNEL法计数囊胚内细胞团和细胞总数以及细胞凋亡数。【结果】Ber组能够极显著促进猪卵母细胞体外成熟,显著降低猪卵母细胞玻璃化冷冻的化学损伤,促进猪卵母细胞冷冻解冻后的细胞存活率,而猪MII期卵母细胞相对于GV期卵母细胞具有很好的冷冻解冻后的存活率;小檗碱能降低猪卵母细胞玻璃化冷冻后的脂滴含量,MⅡ期卵母细胞冷冻前后脂滴含量均低于GV期冷冻前后;小檗碱能够促进猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后的体外成熟,且有利于猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后早期胚胎的发育,相对于冷冻MII期卵母细胞,冷冻GV期卵母细胞具有更好的体外发育效果;小檗碱能够提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外发育囊胚内细胞团数与细胞总数,降低其细胞凋亡,有利于提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外受精胚胎发育至囊胚的质量。而GV期相对MII期则冷冻效果更佳。【结论】小檗碱能够通过降低玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量,从而提高其冷冻解冻后体外成熟率和体外受精胚胎发育质量;GV期玻璃化冷冻卵母细胞相对于MII期,在冷冻解冻后其体外受精胚胎发育质量有更好提高。相关机制还有待今后进一步研究。     

猪精子提取物对猪卵母细胞的孤雌激活效果

3个试验分别就猪精子提取物提取方法、精子蛋白质量浓度以及显微注射剂量对猪卵母细胞的孤雌激活效果进行了研究.结果表明,采用液氮反复冻融法和超声波破碎法提取的猪精子提取物对猪卵母细胞都有显著的孤雌激活效果;采用猪精子提取物显微注射孤雌激活猪卵母细胞的适宜注射剂量为2～4 pL;猪精子蛋白质量浓度在1.35 mg/mL以上,注射剂量为2～4 pL时均可有效激活猪卵母细胞.     

神经生长因子对猪卵丘细胞扩散及卵母细胞体外成熟的影响

利用光学显微镜观察及地衣红染色方法,探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加神经生长因子(NGF对猪卵丘细胞扩散和卵母细胞成熟的影响.结果表明:在猪卵母细胞体外成熟过程中添加NGF对猪卵丘细胞扩散无明显影响;单纯添加NGF并不能显著改变第二次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的比率,但却可以显著提高生发泡期(GV期)卵母细胞比率.当NGF与促性腺激素(eCG和hCG)联合作用时,MⅡ期卵母细胞比率相对于单纯地促性腺激素作用有显著提高.     

猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存技术研究

旨在探讨提高猪GV期卵母细胞冷冻保存效率的可能途径。将EDS、EFS40和ES冷冻保护液用作卵母细胞冻前、冻后程序的处理,但不冷冻,比较3种冷冻保护剂对猪GV期卵母细胞的毒性作用;采用ES液作玻璃化液,比较常规细管法、OPS法和电镜铜网法3种冷冻载体对猪GV期卵母细胞的冷冻效果;并以ES液作玻璃化液,OPS管为冷冻载体,将猪GV期卵母细胞分5组,即对照组、CB+离心处理组、直接冷冻组、CB+冷冻组、CB+离心+冷冻组进行对比处理,比较各处理卵母细胞的冻后存活率与发育率。结果表明,在不同冷冻保护液中,以ES液组合作为玻璃化冷冻液时的毒性作用最低,与对照组间无明显差异(P>0.05);在3种冷冻载体中,用OPS法冷冻猪GV期卵母细胞,所获冻后存活率明显高于电镜铜网法和细管法(65.4%对45.0%和38.6%,P<0.05),并可获得最佳的冻后成熟率(43.3%);猪GV期卵母细胞单纯经细胞松弛素B和离心极化处理,不会严重影响卵母细胞的存活,但卵裂率显著低于对照组(39.0%对52.1%,P<0.05);细胞松弛素B处理或细胞松弛素B+离心极化处理后再进行玻璃化冷冻,并不能提高卵母细胞的冻后存活率与发育率。采用OPS法直接进行GV期卵母细胞的玻璃化冷冻,可获得7.8%的冻后卵裂率,并能获得桑椹胚发育,是一种有效的猪卵母细胞冷冻保存技术。