鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的鸡传染性支气管炎病毒免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Ag8．653融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F4F7D9、3E9G3D4、48883F8。通过间接ELISA、血凝抑制以及琼脂糖扩散等方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达10^6以上并且具有良好的特异性。     

抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应.     

抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

[目的]制备抗猪瘟病毒（CSFV）的单克隆抗体（MAb）。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4～6周龄BALB／c雌鼠,取其脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1AS、5F3和4D2。Mab亚型鉴定表明3株MAb均为IgG2b,轻链均为K链。Westernblot结果表明3株Mab均能识别重组E2蛋白。间接免疫荧光试验表明3株Mab均与CSFV呈阳性反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）呈阴性反应。[结论]该研究为建立CSFV特异性检测方法奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及特性分析

为制备猪流行性腹泻病毒(PDEV)的单克隆抗体,并鉴定单克隆抗体特性。本试验采用差速和蔗糖梯度离心纯化PEDV抗原,免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经ELISA方法筛选和细胞克隆,得到能分泌鼠抗PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备出相应的单克隆抗体,并分析其特性。试验结果:获得2株能稳定分泌抗PEDV的单克隆抗体,命名为E1和H6株,其中E1单隆抗体为IgG2a亚型,H6单隆抗体为IgM亚型,2株单克隆抗体均具有IFA、ELISA和Western bloting特性。E1杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别26和105,H6杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别24和104。2株单克隆抗体与Vero细胞、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均无交叉反应。Western bloting测定结果表明,E1株单克隆抗体能识别PEDV的M蛋白,H6单克隆抗体能识别PEDV的N蛋白。PEDV单克隆抗体的成功研制,为PEDV免疫诊断、表位识别及蛋白研究奠定了良好基础。     

猪流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(MAb),采用差速离心法纯化H1N1和H3N2亚型SIV后交叉免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过建立的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)单克隆抗体检测方法进行筛选。获得3株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为16D5、18G8和20C4,将它们诱导小鼠产生的腹水IPMA效价分别为1×10~(-6)、1×10~(-6)和1×10~(-5)。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链为κ链。3株单克隆抗体特异识别H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亚型流感病毒,并且与猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒无交叉反应。Western blot检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清均在56 ku附近出现一条特异性的蛋白质条带,说明针对SIV的NP蛋白制备了3株单克隆抗体。综上,成功制备了针对SIV NP蛋白的3株单克隆抗体,可识别不同亚型的SIV。     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

抗新城疫病毒中和性单克隆抗体研制和特性分析

应用杂交瘤技术,以纯化的NDV-lasota为免疫原结合间接ELISA筛选到了24株抗NDV单抗,其中3 株(McAb-14、McAb-18和McAb-21)具有中和活性,并与其血凝抑制效价具有很大的相关性。McAb-18和 McAb-21的免疫球蛋白亚类都属于IgG2a;McAb-14为IgG2b。特异性鉴定结果表明:3株抗NDV的单抗均不与马立克病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒等发生交叉反应。用这3株中和单抗的任2种混合液对鸡进行了被动免疫治疗和免疫预防试验,结果表明:McAb-14 McAb -18组合的免疫预防和治疗效果最好。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备与特性分析

【目的】制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体,探讨单克隆抗体临床应用的价值及病毒蛋白的结构和功能。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心纯化的PRRSV抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞常规融合,经间接ELISA的筛选和有限稀释亚克隆,获得能稳定分泌鼠抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA、Western blot和免疫荧光试验等方法分析其特性。【结果】成功地获得了3株稳定分泌抗PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为A61、B47和C65。这3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG3和IgG1,均具有ELISA、IFA和Western blot特性,细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别为1×27~1×28和1×105~1×106。特异性测定结果表明,3株单克隆抗体与Marc-145细胞、猪2型圆环病毒和猪细小病毒均无交叉反应。Western blot测定结果表明,3株单克隆抗体均能特异性识别PRRSV-GP5蛋白。【结论】获得了特异性识别PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体,为PRRS免疫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

鸡IgG单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]制备鸡免疫球蛋白单克隆抗体,提高诊断鸡特异性抗体的水平。[方法]应用盐析法粗提和葡聚糖G200凝胶层析分离纯化鸡血清IgG,免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合和ELISA筛选。[结果]间接ELISA法检测C44、C45、C67和C68共4株鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞的腹水效价分别为1∶640000、1∶320000、1∶640000和1∶80000。Westernblot分析显示,C44和C45株单克隆抗体识别鸡IgG轻链,而C67和C68株单克隆抗体识别鸡IgG重链,它们与鸭、猪等血清Ig均没有反应。小鼠Ig亚类分析表明,4株细胞分泌的抗体均为IgG1型。[结论]成功获得了4株稳定分泌鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞。     

环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体的研究

 采用纯化的鸡IgG免疫环磷酰胺预处理BALB/c小鼠后，再用亲和层析纯化的鸡IgM进行免疫，运用淋巴细胞杂交瘤技术，以间接ELISA法筛选，获得了5株能稳定地分泌抗鸡IgMμ链特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA交叉反应性试验和羊抗鸡IgMμ链抗血清阻断试验，证明这5株单克隆抗体均是抗鸡IgMμ链特异性的。采用环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体，其杂交瘤细胞阳性率为8.696%,而用常规免疫法为4.032%,前者比后者杂交瘤细胞阳性率提高1倍以上。经两次有限稀释法克隆和比较后，免疫抑制法获得5株单克隆抗体，而常规免疫法只获得2株单克隆抗体，前者有3株单克隆抗体腹水ELISA效价达到10#+（-12）、10#+（-14）、10#+（-15）；后者单克隆抗体腹水ELISA效价为10#+（-5）和10#+（-6）。因此，与常规免疫法相比，环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体具有杂交瘤细胞阳性率高，分泌的单克隆抗体特异性强、滴度高等优点，值得推广。