苎麻EST-SSR引物开发和高多态性位点分析

根据NCBI数据库中苎麻表达序列标签EST数据设计7对EST-SSR引物,筛选出2对多态性引物,增加SSR的可用引物数量,进一步完善SSR分子标记体系;采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因分型和测序等3种方法,分析苎麻2个高多态微卫星位点。结果表明:一个微卫星不仅有重复单元次数的变化,而且其两翼也存在简单序列变异,包括核苷酸插入、删除和碱基替换;另一个复合型微卫星各组分均存在碱基增加或删除和碱基置换。根据该位点序列的高变异性,将其作为SNP分子标记,用于苎麻系统发育关系及居群遗传学研究。     

基于转录组测序开发糜子SSR标记

【目的】 以6份不同地理来源的糜子资源为试验材料,基于前期转录组测序获得的1 000对SSR引物,选出200对进行多态性检测,以期构建一批可以准确评估糜子种质遗传差异的分子标记。【方法】 用Primer Premier 5.0软件设计引物,改良CTAB法提取DNA,PCR扩增DNA和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选引物多态性;用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数。【结果】 200对引物中97对呈单态性,80对呈多态性。单碱基序列重复引物有20对,10对具多态性,其重复基元是A（50%）和T（50%）。二碱基序列重复引物有36对,15对具多态性,其碱基重复类型有7种（AG最多,TC、GC和GA次之,CA、TA和AC最少）。三碱基序列重复引物有144对,55对具多态性,其碱基重复类型有24种（GGC、GCG和GCC最多,GAA、GCT和CGC等次之,ACC、AGG、CAG、CGT、AAG、AAC、TCG、CGA、ATT、CAA和CCA最少）。就引物分辨率(Rp)值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.67—4.67（平均2.07）、1.33—4.33（平均2.73）和0.67—4.00（平均1.83）。基于Rp值分析SSR分布频次,发现80个标记分布在5个区间：0—1、1—2、2—3、3—4和4—5,分别包含17（21.25%）、36（45.00%）、11（13.75%）、14（17.50%）和2个（2.50%）。就$\overline{\text{Rp}}$值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.33—0.67（平均0.51）、0.40—0.78（平均0.59）和0.33—0.83（平均0.59）。单碱基序列重复标记共检测到22个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.2000）,其中8个和2个位点分别具2和3个变异;二碱基序列重复标记共检测到38个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.5333）,其中7个和8个位点分别具2和3个变异;三碱基重复标记共检测到136个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.4727）,其中29个和26个位点分别具2和3个变异。就多态性信息含量而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.3750—0.5355（平均0.4293）、0.2392—0.7438（平均0.4293）和0.2392—0.7438（平均0.3989）。就多样性指数而言,1—3碱基序列重复分别为0.6365—1.0776（平均0.7497）、0.5623—1.0986（平均0.8339）和0.5623—1.0889（平均0.8312）。【结论】 基于转录组测序结果,检测200对SSR引物的多态性,发现177对（88.5%）可以扩增出完整条带,其中80对具多态性,多态率为40%。     

一种基于聚合酶链式反应检测SNP的方法

SNP是具有广泛利用潜力的第3代分子标记,本文旨在开发一种利用PCR技术快速检测SNP的方法。设计思路是:根据已知SNP位点设计2条特异正向引物,其最后一个碱基分别与已知SNP的2个碱基相同,同时在1条引物的5′端添加1段20 bp左右的其他物种的特异序列(如细菌DNA序列),然后选择1条合适的反向引物;最后同时加入3条引物,通过梯度PCR选择合适的退火温度进行PCR反应。利用这一方法成功将玉米的ZDS基因定位在玉米第7染色体短臂7.02 Bin。这种检测SNP的方法设计简单,费用低廉,尤其适合SNP标记的分子标记连锁图构建或者基因定位。     

大豆基因组保守序列及综合保守序列扩增多态性分子标记(ICSAP)的设计

采用VBA程序查找了大豆基因组保守序列——在基因组中出现次数较多的碱基序列片段,分析了这类保守序列的基本特性,在此基础上,设计了一种新型分子标记——综合保守序列扩增多态性分子标记.碱基数目越多,保守序列种类数和出现次数越少,从10个碱基到27个碱基,保守序列的GC含量先是逐渐增加,达到一个平台后又逐渐降低.碱基离保守序列3＇端越近,出现A或T的可能性越大,碱基在保守序列中的分布具有非随机性.不同长度的保守序列具有明显的进化关系.筛选出10个碱基的保守序列和长度为8个碱基的填充序列用来设计引物,共得到566对引物组合.该新型分子标记有望在条带多态性、引物一致性等方面超越现有分子标记,同时具有成本低廉等优点.该研究旨在为基因组保守序列查找和分子标记设计方面提供新的思路,分析这些保守序列特性有助于进一步探索分子进化机理.该新型分子标记有可能在大豆种质资源鉴定和基因图位克隆等方面得到应用,同时该分析方法也适用对其他物种.     

山核桃SRAP体系的建立及与RAPD和ISSR标记的比较

以山核桃Carya cathayensis基因组DNA为模板,对聚合酶链式反应（PCR）体系各组分进行了梯度实验,优化出条带清晰、重复性好的相关序列扩增多态性聚合酶链式反应（SRAP-PCR）扩增体系,并筛选了引物。该体系（25.00 μL）为：1 × 缓冲液0.20 mmol·L^－1,脱氧核糖核苷酸（dNTPs）,0.20 μmol·L^－1 引物,2.00 mmol·L^－1镁离子（Mg²⁺）,33.34 nkat Taq DNA 聚合酶,0.80 mg·L^－1基因组DNA（以上均为终浓度）。反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,35 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,5个循环;94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;72 ℃延伸8 min,4 ℃保存,反应时间比其他体系缩短了一半。从100对引物中筛选出了适用于山核桃的引物15对。在山核桃中,随机扩增多态性DNA（RAPD）,简单序列重复区间（ISSR）,SRAP等3种标记,以SRAP标记每对引物扩增的位点数及每对引物扩增的多态性位点数为多,但SRAP多态性引物的比例、多态性位点比例居于另2种标记之间。在山核桃研究中可以考虑使用SRAP及RAPD标记。图6表4参28     

基于RAD-seq技术的金银花SSR标记开发及鉴定

  目的  通过开发特异性高的多态性分子标记位点,以弥补金银花在简单重复序列（SSR）标记方面的匮乏,推动金银花在遗传资源管理及良种鉴定等方向的研究,为后续全基因组测序及组装策略奠定基础。  方法  运用RAD-seq技术对2份金银花样品进行简化基因组测序,利用MISA软件识别contig上的SSR序列并对各类型序列特征进行归纳分析,进而设计引物并利用生物信息学的方法进行引物筛选和有效性检测。  结果  对‘九丰一号’和‘亚特’金银花进行简化基因组测序,分别获得27.805 Mbp和42.560 Mbp干净读长。在组装的45 850个基因序列中共检测到46 999个SSR位点,其中单核苷酸重复单元比例最高（49.15%）,六核苷酸重复单元最少（0.20%）。SSR位点的重复基序以（A/T）n为主,具有偏向性。除单碱基和二碱基重复类型外,SSR位点基序的重复次数集中在5 ~ 6次,且随重复次数增加,SSR位点重复类型出现的频率呈下降趋势。金银花基因组SSR序列长度介于10 ~ 310 bp之间,随重复次数增加,各SSR序列出现的频率逐渐下降。利用Primer3.0成功设计出38 507对SSR引物,设计成功率为81.93%。对挑选的35对SSR引物进行多态性分析,等位基因数、观测杂合度和多态性信息含量（PIC）的平均值分别为5.057、0.363和0.568,其中高多态信息位点26个,中度多态信息位点9个,均未偏离哈迪–温伯格平衡。  结论  利用RAD-seq技术可实现SSR标记的大量开发和多态性SSR引物的筛选,并为金银花在遗传多样性分析和种质鉴定等相关方面的研究提供数据支持。      

菠萝EST资源的SSR信息分析与开发

表达序列标签-简单重复序列(EST-SSRs)存在于表达序列标签中,是一种最常用的新型微卫星标记。它可以被嵌入到功能基因序列中,有效并高效地提供更多的相关信息。通过对已公开的5 659条菠萝Ananas comosus的表达序列标签(ESTs)进行电子筛选,获得了617条含有简单重复序列(SSR)的菠萝EST。平均7.39 kb EST序列中含有1个SSR,其中二核苷酸,三核苷酸和六核苷酸是SSR的主要重复类型,分别占SSR总数的42.61%,29.25%和20.13%。所有重复类型中重复次数最少的是四核苷酸序列(3.46%)。AG/TC是二核苷酸中的优势单元。根据搜索出的EST序列,共设计出30对物,其中27对引物扩增产物具有多态性。本次实验中开发的EST-SSR标记是迄今为止有关于菠萝的第1次大规模SSR标记开发。研究结果为利用EST-SSR分子标记进行菠萝连锁图谱构建,数量基因定位,种质资源遗传多样性,亲缘关系研究和指纹图谱构建奠定了基础。     

靶向测序基因型检测（GBTS）技术及其应用

借助于分子标记进行基因型检测的技术在生物遗传改良等领域发挥着重要的作用。国际跨国种业公司凭借其高通量、自动化、大规模的共享检测平台,基因型检测技术得到广泛应用。随着从3G时代的高成本固相芯片和随机测序式基因型检测（genotyping by sequencing,GBS）发展到成本低、对检测平台要求较低、基于靶向测序基因型检测（genotyping by target sequencing,GBTS）的液相芯片,基因型检测技术完成了向4G时代的转变。在本文中首先介绍了两项最新的GBTS技术（基于多重PCR的GenoPlexs和基于液相探针捕获的GenoBaits）及其原理。同时,发展了可以在单个扩增子内检测多个SNP,称之为多聚单核苷酸多态性（multiple single-nucleotide-polymorphism cluster,mSNP或multiple dispersed nucleotide polymorphism,MNP）的技术,极大地提高了目标位点（扩增子）内变异的检测效率。与GBS和固相芯片相比,GBTS技术具有平台广适性、标记灵活性、检测高效性、信息可加性、支撑便捷性和应用广谱性。同一款标记集（例如玉米40K mSNP）,可以获得3种不同的标记形式（40K mSNP、260K SNP和754K单倍型）;并可以根据应用场景的需求,通过控制测序深度获得多种不同的标记密度（1—40K mSNP）。GenoPlexs和GenoBaits 2种技术相结合,可广泛应用于生物进化、遗传图谱构建、基因定位克隆、标记性状关联检测（全基因组关联分析——GWAS和混合样本分析——BSA）、后裔鉴定、基因渐渗、基因累加、品种权保护、品种质量监测、转基因成分/基因编辑/伴生生物检测等领域。目前,已经在20余种主要农作物、蔬菜以及部分动物和微生物中开发了GBTS标记50余套,并已广泛应用于上述领域。最后,展望了与未来GBTS应用相关的几个问题,包括便携式、自动化、高通量、智能化检测平台;根据用户需求定制的可变密度、多功能分子检测;GBTS与其他技术（KASP、高密度芯片、BSA策略等）的整合;基于资源共享的开源育种等。这些将推动GBTS技术在动物、植物和微生物遗传改良等领域的广泛应用。     

应用 SRAP 分子标记构建黄麻遗传资源 DNA 指纹图谱

以36个黄麻野生种和栽培种为材料,对其基因组DNA进行相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记分析．结果表明：从50对引物中筛选出扩增带型好、品种间带型差异明显、易于识别的34对多态性引物,共扩增出1845条多态性条带,平均每对引物扩增出51．25条,最后从中筛选出14对核心引物构建了36个黄麻品种的DNA指纹图谱,每个品种均有各自特异的DNA指纹,可为黄麻种质资源分子身份证绘制提供依据．     

小麦2D染色体上多酚氧化酶（PPO）基因STS标记的开发与应用

 【目的】开发出小麦籽粒PPO活性的分子标记,并对新标记的应用进行研究,为面制食品外观品质的改良提供参考。【方法】根据一条由小麦2D染色体上PPO基因编码的mRNA序列（GenBank：AY515506）设计引物,对7个高PPO活性和7个低PPO活性小麦品种进行PCR扩增,筛选出有差异的引物,对130份小麦品种资源进行检测,验证不同带型与PPO活性的相关性,并利用一套中国春缺体、四体及双端体对STS标记进行染色体定位。在此基础上,结合一个位于小麦2A染色体上的PPO基因分子标记（PPO18）,对新开发的标记在小麦低PPO活性分子标记辅助选择中的作用进行评价。【结果】在AY515506的不同位置共设计了8对引物,其中一对引物（STS01）在高、低PPO活性材料中表现出多态性。该引物在7个低PPO活性的材料中能扩增出560 bp的目标片段,在7个高PPO活性的材料中没有扩增出目标片段,利用中国春缺体、四体及双端体最终将该标记定位在2D染色体长臂上。利用该标记检测130份小麦品种,结果表明有75个品种可以扩增出560 bp的目标片段,其PPO活性均值为221.08 A475/（min•g•103）;55个品种没有扩增出目标片段,PPO活性均值为309.98 A475/（min•g•103）,方差分析表明两者的差异达极显著水平（P＜0.01）。利用STS01和PPO18共同检测后发现,130份品种中,有37个品种的双标记扩增均表现出高活性带型（H1H2）,这些品种PPO活性的均值为337.82 A475/（min•g•103）,显著高于其它几种扩增带型品种的PPO活性均值（P＜0.01）。32个双标记扩增均表现为低活性带型（L1L2）的小麦品种PPO活性值普遍较低,可作为改良面制食品外观品质的候选亲本。【结论】STS01是一个位于小麦2D染色体长臂上PPO基因分子标记,可以在小麦PPO活性分子标记辅助选择中加以应用。     

差异显示法克隆水稻抗白叶枯病相关蛋白激酶基因(英文)

利用已知植物的蛋白激酶及抗病基因氨基酸序列,设计含激酶保守功能域的简并引物,运用ｍＲＮＡ差异显示技术显示经病原菌诱导的抗性品系（ＩＲ２６）及感病品系（金刚３０）愈伤组织ｍＲＮＡ表达差异,并对差异片段分子克隆．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果提示克隆片段确受白叶枯病病菌诱导表达且该基因仅在抗性品系ＩＲ２６中存在高水平表达．     

EST-SSRs在小麦研究中的应用

小麦EST-SSR s是从小麦ESTs序列中开发的一种新型SSR标记。这种分子标记来源于表达基因,其多态性直接反映了基因的多样性,基于表达序列设计的小麦EST-SSR s引物具有很好的扩增效果,在小麦遗传分析中应用广泛。本文阐述了EST-SSR s的特点,介绍了小麦EST-SSR s的研究进展。     

利用SSR标记鉴定主要梨栽培品种

为了维护生产者和育种者的利益,提供快速可靠的品种鉴定方法具有重要意义。笔者根据目前基因库中梨的DNA收录序列设计开发SSR引物,用筛选出的6对图谱清晰SSR引物对19个主要梨栽培品种进行SSR分析。通过类似于植物常规分类方法,编制19个梨品种的指纹检索表,可以将供试的19个主要梨栽培品种鉴别分开。通过检索GeneBank收录的DNA序列作为筛选SSR标记的途径,大大降低了引物开发的成本和缩短了SSR体系建立的时间,是一种简单、快速的方法。     

Isolation, Identification of Differentially Expressed Sequence Tags in the Backfat Tissue from Meishan, large White and Meishan×Large White Cross Pigs

In order to detect the molecular mechanism of heterosis in pigs, the mRNA differential display technique was performed to investigate the differences of gene expression in the backfat tissue from Meishan,Large White and Meishan×Large White cross pigs.Nine 3'-end anchored primers in combination with ten 5'-end arbitrary primers were used to perform the differential display PCR and nearly 3 000 reproducible bands were examined .Fifteen expressed sepuence tags that were differentially expressed were isolated and then isdentifide through semi-quantitative RT-PCR.BLAST analysis revealed that the fifteen expressed sequence tags (ESTs) were ntt homologous to any of the known porcine genes or ESTs. These novel ESTs were then submitted to GenBank.     

沙冬青GATA型锌指蛋白基因序列及表达分析

根据沙冬青低温干旱诱导cDNA文库表达序列标签中锌指蛋白基因序列设计特异引物,采用PCR技术扩增锌指蛋白基因AmZFPG的cDNA全长.序列分析表明,cDNA全长669 bp,推测编码223个氨基酸残基、分子量约25 kD的蛋白质.氨基酸保守性分析及同类锌指结构比对表明AmZFPG属于GATA结合蛋白家族,且具有高度的...     

蝴蝶兰EST资源的SSR信息分析

对5 472条蝴蝶兰无冗余EST序列进行了SSR搜索,共检索出 376条EST含有419个SSR位点,平均每7.4 kb EST序列出现1个SSR.共有60种SSR的重复基元.其中二核苷酸和三核苷酸重复基元占丰导地位,分别占SSR总数的67.1%和30.3%:AG/CT在SSR基元中出现频率最高(46.1%).AT/A...     

鮸鱼EST-cSNP位点发掘及其特征分析

为发掘鮸鱼的EST-cSNP位点,以测序获得的鮸鱼脾脏4609条高质量表达序列标签(expressed sequence tags,EST)序列为源序列,利用Vector NTI 11.0软件拼接出707条重叠群(contig)序列,检测到209个可信度高的编码区单核苷酸多态性(coding-region single nucleotide polymorphism,cSNP)位点;SNP位点数在包含SNP序列中的发生概率为0.743%,在209个SNP位点中包含114个碱基转换位点、74个碱基颠换位点和21个插入缺失位点,转换与颠换比为1.54;对所鉴定的SNP位点的相关序列进行基因注释表明,这些序列包括一批与免疫抗逆相关的基因,例如主要组织相容性复合体、免疫球蛋白、T细胞受体以及各类蛋白酶等.说明所发掘的SNP将有助于促进鮸鱼的分子遗传学及分子辅助育种研究.     

蜜蜂TPI基因克隆与生物信息学预测(英文)

[目的]克隆蜜蜂(Apis mellifera)TPI基因,并进行生物信息学预测。[方法]利用电子克隆方法获得蜜蜂磷酸甘油醛异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)基因,并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白的等电点、疏水性/亲水性、二级结构等进行了预测。[结果]蜜蜂TPI基因全长为1768bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),所编码蛋白的等电点为8.515。二级结构预测表明TPI蛋白属于α/β蛋白。[结论]利用蜜蜂表达序列标签数据库(EST)电子克隆蜜蜂新基因的研究工作有一定的现实意义,为进一步在分子水平研究蜜蜂提供更多的参考。     

cDNA文库在棉花基因发掘中的应用

构建cDNA文库是发掘基因和研究基因功能的重要工具,也是基因组学研究的重要技术手段。棉花作为世界上重要的经济作物之一,研究人员已经构建了大量的棉花cDNA文库,为棉花基因发掘和功能研究积累了丰富的Expressed Sequence Tags(ESTs)资源。本文对近几年来cDNA文库在棉花基因发掘中的应用进行了总结。     

基于NCBI 数据库的油棕EST-SSR 标记的开发与应用

应用NCBI 网站上释放的41 977 条油棕EST 序列,从中挖掘SSR 位点3 946 个,根据27 个SSR 位点的 侧翼序列设计引物,并对18 份油棕DNA 样品进行扩增,扩增结果显示10 个标记具有多态性。根据这些标记信息, 对这18 份油棕资源进行主成分分析,18 份油棕资源被分成两个遗传群体,一个为文昌高隆湾和文昌椰子研究所的 油棕资源,另一个群体为10 份引自马来西亚的油棕资源。这些研究显示,开发的标记可用于油棕资源遗传多样性评 估、遗传结构评估,并可用于油棕遗传图谱的构建。