基于转录组测序开发糜子SSR标记

【目的】 以6份不同地理来源的糜子资源为试验材料,基于前期转录组测序获得的1 000对SSR引物,选出200对进行多态性检测,以期构建一批可以准确评估糜子种质遗传差异的分子标记。【方法】 用Primer Premier 5.0软件设计引物,改良CTAB法提取DNA,PCR扩增DNA和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选引物多态性;用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数。【结果】 200对引物中97对呈单态性,80对呈多态性。单碱基序列重复引物有20对,10对具多态性,其重复基元是A（50%）和T（50%）。二碱基序列重复引物有36对,15对具多态性,其碱基重复类型有7种（AG最多,TC、GC和GA次之,CA、TA和AC最少）。三碱基序列重复引物有144对,55对具多态性,其碱基重复类型有24种（GGC、GCG和GCC最多,GAA、GCT和CGC等次之,ACC、AGG、CAG、CGT、AAG、AAC、TCG、CGA、ATT、CAA和CCA最少）。就引物分辨率(Rp)值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.67—4.67（平均2.07）、1.33—4.33（平均2.73）和0.67—4.00（平均1.83）。基于Rp值分析SSR分布频次,发现80个标记分布在5个区间：0—1、1—2、2—3、3—4和4—5,分别包含17（21.25%）、36（45.00%）、11（13.75%）、14（17.50%）和2个（2.50%）。就$\overline{\text{Rp}}$值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.33—0.67（平均0.51）、0.40—0.78（平均0.59）和0.33—0.83（平均0.59）。单碱基序列重复标记共检测到22个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.2000）,其中8个和2个位点分别具2和3个变异;二碱基序列重复标记共检测到38个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.5333）,其中7个和8个位点分别具2和3个变异;三碱基重复标记共检测到136个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.4727）,其中29个和26个位点分别具2和3个变异。就多态性信息含量而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.3750—0.5355（平均0.4293）、0.2392—0.7438（平均0.4293）和0.2392—0.7438（平均0.3989）。就多样性指数而言,1—3碱基序列重复分别为0.6365—1.0776（平均0.7497）、0.5623—1.0986（平均0.8339）和0.5623—1.0889（平均0.8312）。【结论】 基于转录组测序结果,检测200对SSR引物的多态性,发现177对（88.5%）可以扩增出完整条带,其中80对具多态性,多态率为40%。     

糜子抗白粉病基因(Mlo)编码蛋白的序列特征及表达分析

[目的]探究糜子抗白粉病基因(Mlo)编码蛋白的序列特征及mRNA表达特性,以期为该基因的克隆提供基础数据。[方法]利用一系列生物信息学软件分析糜子Mlo蛋白理化特性,并采用室内接种和qRT-PCR技术检测在接种白粉菌后,糜子叶片Mlo基因mRNA表达量的变化。[结果]糜子中Mlo蛋白的化学式为C1856H3105N609O756S170,原子总数为6 496个,分子量为51 497.90Da;编码609个氨基酸,含有一个保守结构域(第1～348位氨基酸之间);该蛋白为分泌蛋白,具有信号肽,异亮氨酸为其核输出信号。7种植物Mlo蛋白序列进化树和多重序列比对结果表明糜子与黄瓜的序列一致性为100%,与3种葫芦科植物(西葫芦、苦瓜和南瓜)的一致性超过80%,与陆地棉的一致性为65%,与大豆的一致性为59%。实时定量PCR检测结果表明,在接菌处理后不同时间,糜子Mlo表达水平存在显著差异。随着接种天数增加,Mlo基因相对表达量呈现先增加后降低的趋势。6、9和12d时,mRNA含量与对照组呈极显著差异,9d时表达量最高,为对照的4.33倍,15d时mRNA含量与对照组差异不明显。[结论]糜子Mlo基因可以由接种白粉菌诱导表达。     

利用EST-SSR评估糜子资源遗传差异

【目的】用微卫星标记分析糜子种质资源（国内外6个不同生态区）的遗传多样性水平,揭示不同来源糜子种质资源的亲缘关系和遗传结构差异,便于对糜子资源分类和优异种质的筛选利用。【方法】 用144个（高、低碱基序列重复分别为64和80个）SSR标记评估96份国内外（国内、国外分别为71和25份）糜子资源;用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数,用MEGA 5.0和Structure 2.2进行遗传距离和结构聚类,用Ntsys 2.11进行主成分分析。【结果】 144个EST-SSR标记共检测出368个观测等位变异（Na）,每个位点检测到等位变异2—3个,平均为2.5556个;观测杂合度（Ho）为0.4070（RYW15）—0.9789（RYW85）,平均为0.8288;期望杂合度（He）为0.4369（RYW59）—0.6693（RYW58）,平均为0.5535;Nei's基因多样性指数（Nei）为0.4344（RYW59）—0.6653（RYW58）,平均为0.5505;多态性信息含量（PIC）为0.1811（RYW68）—0.7508（RYW58）,平均为0.4279。Shannon多样性指数（I）为0.6474—1.0956,平均为0.8415。就6个生态区材料的遗传多样性参数而言,北方春糜子区材料的PIC值和Shannon多样性指数最高,西北春夏糜子区材料最低。就不同生态区糜子种质间的遗传距离和遗传一致度而言,不同生态区糜子种质间的遗传距离为 0.0111—0.1425,遗传一致度为 0.8672—0.9889,北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区间遗传距离最小和遗传一致度最高,西北春夏糜子区和华北夏糜子区间遗传距离最大。基于UPGMA聚类将试验材料划归3个类群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。类群Ⅰ主要为北方春糜子区材料;类群Ⅱ主要为国外材料;类群Ⅲ主要为北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区材料;基于Structure聚类将糜子资源划归4个群组,红色群组,主要为北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区材料,代表北方和黄土高原基因库;绿色群组,主要为北方春糜子区材料,代表北方基因库;蓝色群组,主要包括黄土高原春夏糜子区材料,代表黄土高原基因库;黄色群组,代表国外基因库。就各分类群的遗传多样性参数而言,群组Ⅱ的PIC值最大（0.4606）,群组Ⅳ最小（0.3539）;主成分分析将试材划归6类,与其地理来源一致。【结论】 144个SSR标记可以准确评估96份糜子资源的遗传变异,基于不同依据划分的类群与6个生态区材料的地理来源基本一致,北方春糜子区材料的遗传多样性较丰富。     

中国和印度黍稷的遗传差异分析

利用SSR标记分析黍稷种质资源的遗传多样性,以揭示不同来源黍稷种质资源的亲缘关系和遗传群体结构差异,为黍稷起源进化研究奠定基础。采用80对黍稷特异性SSR标记对56份黍稷材料进行PCR扩增,通过进行遗传参数、聚类、主成分、遗传结构等分析,评估不同群体间的遗传多样性,以探讨遗传结构差异。结果表明,中国黍稷资源的多样性指数(0.846 7±0.152 8)和多态性信息含量(0.445 8)均高于印度资源(0.838 0±0.143 5,0.394 8),遗传多样性更丰富;根据UPGMA聚类,将56份材料划分为4个类群,其中,类群Ⅰ有21份,主要包括印度黍稷,其他类群主要为中国黍稷;利用Structure进行群体遗传结构分析,结果显示,56份材料被划分为3个群组,其中,类群ⅰ和类群ⅱ主要包括印度黍稷,类群ⅲ主要包括中国黍稷;主成分分析结果表明,56份黍稷材料共划分为5个类群,这5个类群划分界限清楚,种群结构明显,不同的黍稷有严格的地理分布。     

新孢子虫与弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒的构建及免疫应答分析

为构建新孢子虫和弓形虫AMA1基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,本试验根据新孢子虫和弓形虫AMA1基因序列的开放阅读框,设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因通用引物,构建重组克隆质粒pMD18T-NcAMA1、pMD18T-TgAMA1及重组腺病毒穿梭质粒ADV4-Nc/TgAMA1,将ADV4-Nc/TgAMA1和骨架质粒pacAd5线性化后共转染293T细胞,包装Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒,测定病毒滴度后,收集病毒液接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平。结果显示,Nc/TgAMA1在Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒中获得表达,测定Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒滴度为10⁹PFU/mL,接种BALB/c小鼠后,Ad5-Nc/TgAMA1接种组IgG抗体水平明显高于pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组和PBS对照组。结果表明,构建的Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。本试验为新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。     

40份糜子资源淀粉组成及含量分析

利用双波长比色法在606 nm处测定直链淀粉的波长,参比波长为480 nm;在538 nm处测定支链淀粉的波长,参比波长为708 nm,测定来源于不同地区的40份糜子淀粉的组成及含量,为优质糜子品种选育提供理论依据。结果发现,23份糜子材料为糯性,17份为粳性;总淀粉含量介于58.43%～75.45%,直链淀粉含量介于0～20.34%,支链淀粉含量介于46.70%～69.61%;各地区糜子直链淀粉含量差异显著,而淀粉含量差异不显著。