基于转录组测序开发糜子SSR标记

【目的】 以6份不同地理来源的糜子资源为试验材料,基于前期转录组测序获得的1 000对SSR引物,选出200对进行多态性检测,以期构建一批可以准确评估糜子种质遗传差异的分子标记。【方法】 用Primer Premier 5.0软件设计引物,改良CTAB法提取DNA,PCR扩增DNA和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选引物多态性;用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数。【结果】 200对引物中97对呈单态性,80对呈多态性。单碱基序列重复引物有20对,10对具多态性,其重复基元是A（50%）和T（50%）。二碱基序列重复引物有36对,15对具多态性,其碱基重复类型有7种（AG最多,TC、GC和GA次之,CA、TA和AC最少）。三碱基序列重复引物有144对,55对具多态性,其碱基重复类型有24种（GGC、GCG和GCC最多,GAA、GCT和CGC等次之,ACC、AGG、CAG、CGT、AAG、AAC、TCG、CGA、ATT、CAA和CCA最少）。就引物分辨率(Rp)值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.67—4.67（平均2.07）、1.33—4.33（平均2.73）和0.67—4.00（平均1.83）。基于Rp值分析SSR分布频次,发现80个标记分布在5个区间：0—1、1—2、2—3、3—4和4—5,分别包含17（21.25%）、36（45.00%）、11（13.75%）、14（17.50%）和2个（2.50%）。就$\overline{\text{Rp}}$值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.33—0.67（平均0.51）、0.40—0.78（平均0.59）和0.33—0.83（平均0.59）。单碱基序列重复标记共检测到22个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.2000）,其中8个和2个位点分别具2和3个变异;二碱基序列重复标记共检测到38个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.5333）,其中7个和8个位点分别具2和3个变异;三碱基重复标记共检测到136个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.4727）,其中29个和26个位点分别具2和3个变异。就多态性信息含量而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.3750—0.5355（平均0.4293）、0.2392—0.7438（平均0.4293）和0.2392—0.7438（平均0.3989）。就多样性指数而言,1—3碱基序列重复分别为0.6365—1.0776（平均0.7497）、0.5623—1.0986（平均0.8339）和0.5623—1.0889（平均0.8312）。【结论】 基于转录组测序结果,检测200对SSR引物的多态性,发现177对（88.5%）可以扩增出完整条带,其中80对具多态性,多态率为40%。     

糜子抗白粉病基因(Mlo)编码蛋白的序列特征及表达分析

[目的]探究糜子抗白粉病基因(Mlo)编码蛋白的序列特征及mRNA表达特性,以期为该基因的克隆提供基础数据。[方法]利用一系列生物信息学软件分析糜子Mlo蛋白理化特性,并采用室内接种和qRT-PCR技术检测在接种白粉菌后,糜子叶片Mlo基因mRNA表达量的变化。[结果]糜子中Mlo蛋白的化学式为C1856H3105N609O756S170,原子总数为6 496个,分子量为51 497.90Da;编码609个氨基酸,含有一个保守结构域(第1～348位氨基酸之间);该蛋白为分泌蛋白,具有信号肽,异亮氨酸为其核输出信号。7种植物Mlo蛋白序列进化树和多重序列比对结果表明糜子与黄瓜的序列一致性为100%,与3种葫芦科植物(西葫芦、苦瓜和南瓜)的一致性超过80%,与陆地棉的一致性为65%,与大豆的一致性为59%。实时定量PCR检测结果表明,在接菌处理后不同时间,糜子Mlo表达水平存在显著差异。随着接种天数增加,Mlo基因相对表达量呈现先增加后降低的趋势。6、9和12d时,mRNA含量与对照组呈极显著差异,9d时表达量最高,为对照的4.33倍,15d时mRNA含量与对照组差异不明显。[结论]糜子Mlo基因可以由接种白粉菌诱导表达。     

利用EST-SSR评估糜子资源遗传差异

【目的】用微卫星标记分析糜子种质资源（国内外6个不同生态区）的遗传多样性水平,揭示不同来源糜子种质资源的亲缘关系和遗传结构差异,便于对糜子资源分类和优异种质的筛选利用。【方法】 用144个（高、低碱基序列重复分别为64和80个）SSR标记评估96份国内外（国内、国外分别为71和25份）糜子资源;用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数,用MEGA 5.0和Structure 2.2进行遗传距离和结构聚类,用Ntsys 2.11进行主成分分析。【结果】 144个EST-SSR标记共检测出368个观测等位变异（Na）,每个位点检测到等位变异2—3个,平均为2.5556个;观测杂合度（Ho）为0.4070（RYW15）—0.9789（RYW85）,平均为0.8288;期望杂合度（He）为0.4369（RYW59）—0.6693（RYW58）,平均为0.5535;Nei's基因多样性指数（Nei）为0.4344（RYW59）—0.6653（RYW58）,平均为0.5505;多态性信息含量（PIC）为0.1811（RYW68）—0.7508（RYW58）,平均为0.4279。Shannon多样性指数（I）为0.6474—1.0956,平均为0.8415。就6个生态区材料的遗传多样性参数而言,北方春糜子区材料的PIC值和Shannon多样性指数最高,西北春夏糜子区材料最低。就不同生态区糜子种质间的遗传距离和遗传一致度而言,不同生态区糜子种质间的遗传距离为 0.0111—0.1425,遗传一致度为 0.8672—0.9889,北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区间遗传距离最小和遗传一致度最高,西北春夏糜子区和华北夏糜子区间遗传距离最大。基于UPGMA聚类将试验材料划归3个类群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。类群Ⅰ主要为北方春糜子区材料;类群Ⅱ主要为国外材料;类群Ⅲ主要为北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区材料;基于Structure聚类将糜子资源划归4个群组,红色群组,主要为北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区材料,代表北方和黄土高原基因库;绿色群组,主要为北方春糜子区材料,代表北方基因库;蓝色群组,主要包括黄土高原春夏糜子区材料,代表黄土高原基因库;黄色群组,代表国外基因库。就各分类群的遗传多样性参数而言,群组Ⅱ的PIC值最大（0.4606）,群组Ⅳ最小（0.3539）;主成分分析将试材划归6类,与其地理来源一致。【结论】 144个SSR标记可以准确评估96份糜子资源的遗传变异,基于不同依据划分的类群与6个生态区材料的地理来源基本一致,北方春糜子区材料的遗传多样性较丰富。     

糜子Ty 1-copia型反转录转座子基因的序列特征及表达分析

[目的]发掘抗旱相关基因,明晰其编码蛋白的理化特征,为糜子育种提供基因元件。[方法]利用生物信息学软件、数据库和在线程序,对糜子Ty1-copia型反转录转座子编码蛋白进行生物信息学分析,同时对该基因进行qRTPCR表达特性分析。[结果]Ty1-copia基因编码蛋白分子式为C483H758N122O135S7,分子量为10 658.49Da,呈弱碱性,是不稳定的疏水蛋白;该蛋白为非分泌型蛋白、无跨膜结构,既不存在于叶绿体上也不存在于线粒体上;二级结构包括4个α螺旋,4个β折叠;三级结构包括1个螺旋结构和2个折叠结构;含4个保守结构域;系统进化树和多重序列比对结果显示糜子保守性较低,与水稻类和毛竹的同源性为64%。实时定量PCR检测结果表明,Ty1-copia表达水平在干旱胁迫处理不同时间点存在显著差异,3h时表达量最高,为对照的2.02倍;8h时该基因呈下调表达,表达量低于对照。[结论]Ty1-copia基因可以由干旱胁迫诱导。     

40份糜子资源淀粉组成及含量分析

利用双波长比色法在606 nm处测定直链淀粉的波长,参比波长为480 nm;在538 nm处测定支链淀粉的波长,参比波长为708 nm,测定来源于不同地区的40份糜子淀粉的组成及含量,为优质糜子品种选育提供理论依据。结果发现,23份糜子材料为糯性,17份为粳性;总淀粉含量介于58.43%～75.45%,直链淀粉含量介于0～20.34%,支链淀粉含量介于46.70%～69.61%;各地区糜子直链淀粉含量差异显著,而淀粉含量差异不显著。     

糜子特异性SSR标记的开发

根据山西农业大学农学院植物学实验室前期糜子测序所得的转录组序列,设计70对三碱基重复的SSR引物来扩增6份地域差异较远的糜子品种,筛选出多态性的引物。结果表明,70对引物中,67对可以扩增出条带,3对无扩增结果;67对有扩增结果的引物中,17对具多态性,50对没有多态性。利用17对引物扩增6份试材,共检测到47个等位变异;每个位点的等位变异数为2~4个,平均为2.8个;发现多态性信息含量介于0.239 2~0.671 3,基因多样性指数为0.277 8~0.722 3。该结果可为分子标记辅助育种及进化研究提供理论基础。