Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x＋35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x＋34.890,R2=0.999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]该研究为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源,Ⅲ终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的cz值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的0值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为Y=-3．422x＋35．201,R^2=O．998;外源基因标准曲线方程为Y=-3．348x＋34．890,R^2=0．999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

转OsDREB3基因大豆外源基因拷贝数的确定及标准分子的构建

为建立抗逆转OsDREB3基因大豆快速稳定的品系特异性检测方法,本试验通过实时Real-time PCR方法,以大豆凝集素基因(lectin)作为内源参照基因,确定了外源基因OsDREB3在转OsDREB3基因大豆基因组中的拷贝数为单拷贝,为建立快速、有效的品系特异性检测方法奠定基础.同时,在原有构建的含4种转基因大豆品系特异性序列的标准分子载体上又增加了转OsDREB3基因大豆品系特异性序列,新构建了含有5种转基因大豆品系特异性序列的标准分子及大豆内参照基因(lectin),已完全满足对现有国内覆盖面最大的5种转基因大豆同时、快速筛查检测工作的需要.     

抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。     

利用微滴数字PCR技术分析转基因大豆‘GE-J12’中外源基因的拷贝数

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字PCR拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字PCR检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。     

转基因耐除草剂大豆及产品中外源成分检测方法的建立

分别从DNA和蛋白质2个水平上对转基因耐除草剂大豆及其产品的检测方法进行了研究．设计合成引物检测大豆内参照基因Lectin（大豆凝集素）及转基因抗除草剂Roundup Ready大豆外源基因,包括来自土壤细菌Agrobacterium tumefaciens株系CP4的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3phosphate synthase,EPSPS）基因、花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaicvirus,CaMV）35S启动子、胭脂碱合酶3’端的转录终止子（nopaline synthase,NOS）．应用优化的常规PCR方法,对大豆及其加工产品进行了检测,检测灵敏度可达0．1％．通过PCR方法从转基因大豆中扩增出CP4-EPSPS基因,在大肠杆菌中表达,利用表达的外源蛋白质作为抗原免疫家免,得到该蛋白质的多克隆抗体,并建立了一套基于蛋白质印迹杂交（western hybridization）的检测转基因大豆及其粗加工品的方法,其检测极限达到1％以下．此两方法互相配合,互相印证,有助于规范化转基因检测方法的建立．     

转基因大豆研究及应用进展

转基因技术是一种以分子生物学技术为核心,对基因进行修饰、改造,从而定向改变生物体遗传性状的技术。基于转基因技术在大豆中的应用,从技术研发手段、外源基因挖掘、转基因大豆品种、大豆除草剂、种植面积、研发体系等方面对国内外转基因大豆研究及应用进展进行概述,以期为发展中国大豆转基因技术提供借鉴和参考。分析指出,国外转基因大豆研发能力较为成熟,大豆外源基因转化技术主要采用农杆菌介导转化法和微弹轰击法,通过cp4、dmo、Pat、cry1Ac、fatb1-A等目的基因的表达,得到抗虫、抗除草剂、高油酸以及具复合性状的大豆品种,同时转基因产权保护体系比较健全,促进转基因大豆的产业化;而中国转基因大豆研究多为基础性研究,侧重于基因检测和再生体系培育,外源基因转化技术缺乏创新性,存在转基因安全性结论未定、舆论环境尴尬、研发体系不完善、审批过程复杂、具有完全自主知识产权的基因开发数量少,高油、抗生素抗性等功能性基因挖掘不足等问题,制约中国转基因大豆产业化进程。今后应改革高校和科研机构考核制度、强化产学研模式、完善转基因产权保护机制、加强转基因科普与监管,为转基因技术及其产业化营造更加健康的发展环境。     

DP -305423转基因大豆PCR检测方法研究

根据DP- 305423外源插入片段与植物基因组序列设计特异性引物,以leetin基因(118 bp)作为内参照基因,筛选最佳引物并对反应程序和反应体系进行优化,最终建立转基因大豆DP - 305423转化体特异性定性PCR检测方法.对该方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性测试.结果表明:该方法能够特异性检测出DP...     

转hrpZpsta抗病基因大豆的研究

【目的】将具有广谱抗病性的hrpZpsta基因导入大豆,为培育抗灰斑病的转基因大豆新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为受体,将具有广谱抗性的hrpZpsta基因转入大豆品种"吉林30"中,以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对转基因植株进行PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测分析。【结果】确定的NaCl筛选浓度为200mmol/L。对T1、T2和T3代转基因植株进行PCR检测,得到T1代阳性植株30株,T2代45株,T3代284株,说明外源hrpZpsta基因在转基因后代中能够遗传。Southern杂交结果表明,外源目的基因hrpZpsta已经整合进大豆基因组中,且整合位点不尽相同。RT-PCR结果表明,hrpZpsta基因在受体大豆中获得表达。【结论】获得了hrpZpsta基因遗传表达的T3代转基因大豆株系。     

马铃薯T-DNA插入拷贝数的检测及对农艺性状的影响研究

以转基因马铃薯株系为材料,采用Real-time PCR方法,以SYBR Green I为荧光染料,以马铃薯块茎贮藏蛋白基因(Patatin)作为内参基因,以植物表达载体上的潮霉素抗性基因(HPT)为筛选标记基因,建立目的基因CT值与起始模版的相关性标准曲线,通过实时荧光定量PCR分别获得每个样品中内参基因和外源基因的CT值,根据Pfaffl法计算获得了T-DNA在转基因马铃薯中的拷贝数,且与Southern blot方法进行了比较,并结合田间农艺性状,分析了外源基因拷贝数马铃薯株高及薯块产量的影响。结果表明,内参基因和外源基因标准曲线的相关系数分别为R2=0.996、R2=0.995和R2=0.990。在所测的23株转基因株系中,12株为单拷贝插入,6株为双拷贝,5株为多拷贝。Real-time PCR比Southern blot方法结果更准确、操作更简便快捷、成本更低。且插入拷贝数的多少与马铃薯田间农艺性状变化有一定的关系,发现2拷贝以上的T-DNA插入较容易引起部分性状的改变。     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR法检测 转基因植物外源基因拷贝数的差异分析

探讨TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR 2种方法检测转基因植物外源基因的拷贝数方法的差异。以12株T0转基因水稻为材料,分别用TaqMan与SYBR Green实时定量PCR法检测其拷贝数,然后用SAS 9.1软件对2种方法的结果进行t检验分析。通过SAS对2组数据的t检验分析,在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green与TaqMan探针法的结果接近,差异不显著;当内参基因与目的基因扩增效率差异明显时,SYBR Green与TaqMan探针法差异显著。在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green法测定转基因植物外源基因的拷贝数时结果接近TaqMan探针法。     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

Comparison of Two Real-time PCR Technigues for Quantification of GMO Contents in Highly Processed Products of Soybean

The RR soybean was quantitatively detected by ABI Prism 7300 sequence detector with PCR primers and fluorescence probes were designed according to the sequences of endogenous Lectin gene and exogenous CP4-EPSPS gene, and the PCR systems were based on SYBR GreenΙand TaqMan. The standard curve of °Ct between CP4-EPSPS gene and Lectin gene of the RR soybean in standard materials was generated and a linear regression equation was obtained. Quantification methods were optimized through two different real-time PCR chemistries, i.e. SYBR GreenΙand TaqMan, and the RR soybean contents were quantified in five standard samples and seven highly processed products by the two assays. Both methods are proved to be specific, highly sensitive and reliable for both identification and quantification of soybean DNA. The results indicate that the two optimized PCR system can be used for the practical quantitative detection of RR soybean in highly processed products.     

转基因小麦B73-6-1外源基因拷贝数的确定

为了确定转基因小麦B73-6-1中外源基因HMW-GS的拷贝数,以期为HMW-GS基因的整合位点和遗传表达研究奠定基础,构建了含有外源基因HMW-GS的标准品,并以wx012基因作为内源参照,通过实时荧光定量PCR方法,进行了3次重复试验。结果表明,在3组试验中得到的HMW-GS基因分子数分别为8.62×1018、4.34×1018、1.10×1018个,wx012基因分子数分别为6.27×1017、3.14×1017、7.84×1017个,经计算HMW-GS基因拷贝数分别为13.75、13.84、14.01个,由此确定转基因小麦B73-6-1中HMW-GS外源基因的拷贝数为14个。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0．99以上;最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。     

奶牛隐孢子虫SYBR Green Real-time PCR检测方法的建立

为建立一种方便快捷的检测奶牛隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,根据GenBank中已发表的隐孢子虫18s rRNA基因设计一对引物,并以从卵囊中提取的DNA为模版,初步建立了检测奶牛隐孢子虫的SYBR Green Real-time PCR方法,进而对采集的奶牛粪便进行了特异性、敏感性和重复性检测。结果显示,本研究建立的Real-time PCR方法敏感性高,最低检测阈为10个拷贝的质粒DNA和1g粪便中的10个卵囊,扩增产物的特异性良好,重复性试验的标准差为0.494,重复性良好。研究表明,建立的Real-time PCR快速、特异、敏感,可用于奶牛隐孢子虫病的流行病学调查。