PCV2套式PCR检测方法的建立及应用

根据猪圆环病毒2型GD株及已发表的PCV2的全基因组序列,设计1对PCV2型特异性引物,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18-T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中,提取质粒进行套式PCR、酶切、测序鉴定,结果扩增出了PCV2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在90%以上。用该PCR方法对287个猪场的1 560份样品进行了检测,其中983份为PCV2阳性,阳性率为63%。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中PCV2和PCV1的基因组序列设计3条引物,并建立了检测PCV2的复合PCR方法。用该方法对河南省7个地市45个猪场的156份样品进行了检测,检出阳性病料98份,阳性率63%;阳性猪场38个,阳性率84%,表明该方法特异性及敏感性高,可用于临床诊断。     

猪环状病毒2型的PCR检测方法的建立及应用

根据国外已发表的猪环状病毒2型（PCV－2）的全基因组序列，设计一对2型特异性引物，对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD18－T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中，经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定，证明扩增出了PCV－2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV－2序列进行比较，发现同源性均在90％以上。用该PCR方法在43份可疑病料中检测到了12分PCV－2阳性病料，表明该病在我国已有流行。     

PCV2的PCR鉴定及其相关序列分析

设计合成了2条猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2)PCR引物,对杭州地区发现的PCV2可疑病例进行PCR鉴定,并优化了PCR反应条件,进行了敏感性、特异性试验,对其扩增序列进行测序比较.结果显示,用所设计的2条引物成功扩增了PCV2基因片段,PCV2基因片段序列与参考序列相似性达到91.2%.说明所设计的引物用来检测临床病理中PCV2是准确可行的.对杭州地区的56份病料的检测结果:感染率为57%,表明杭州地区的感染已经比较严重.     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用.【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测.【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×103、4×103copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性.该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(Pgt;0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于PCV1.【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势.     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用.【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测.【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×103、4×103copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性.该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(Pgt;0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于PCV1.【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪Ⅱ型圆环病毒混合感染的诊断

采用病理学、PCR等实验室检测方法对采自吉林省某猪场的发病猪组织病料进行PRRSV、PCV2检测,结果表明该猪场的发病猪存在PRRSV和PCV2混合感染。对PRRSV和PCR扩增结果进行克隆分析,该基因序列与模板(EF112445.1)碱基序列有很高的同源性。     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×10~3、4×10~3 copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性。该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(P0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于PCV1。【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势。     

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株(登录号DQ322701)以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株(登录号DQ363860和DQ355153).应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.     

猪圆环病毒2型快速直接PCR检测方法的建立与流行病学调查

为了解河南省猪圆环病毒2型(PCV2)的流行病学情况,参考Gen Bank的PCV2 ORF2的序列,设计1对引物,建立PCV2的快速直接PCR检测方法,并进行特异性和敏感性试验。运用该方法对2016年5月至2017年5月采集到的河南省共125份疑似猪圆环病毒2型的病料进行PCV2检测,阳性样品测序,分析河南省PCV2的遗传变异情况。结果显示,建立的PCR检测方法快速、特异、敏感,适用于临床检测或流行病学调查;所检测的125份样品中,55份样品为PCV2阳性,阳性率高达44%。阳性结果序列分析显示,核苷酸序列同源性在88.7%~99.8%,42份在PCV2b基因群。结果表明,河南省PCV2感染率较高,PCV2b为流行血清亚型,病毒变异严重。     

猪圆环病毒2型的分离与鉴定

以PCR方法,从疑似断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)自然病例的淋巴结和脾脏中扩增出预期长度的猪圆环病毒2型(PCV 2)的DNA片段,测序PCR产物,并对部分序列进行了同源性分析。结果显示,扩增产物与标准毒株的序列同源性均在98%左右,说明扩增产物具有良好的特异性,由此表明分离出的病毒为猪圆环病毒2型。对沪、苏、鲁、浙等地5个猪场进行检测,证实了猪圆环病毒2型的存在。     

猪圆环病毒2型北京株全基因组的克隆与序列分析

为探索近年来北京地区猪圆环病毒2型（PCV2）的流行病学和变异规律,用PCR技术从北京不同猪场的临床发病猪和死亡猪病变组织中分别扩增和克隆获得4株PCV2分离株全基因组序列,并进行测定和分析。结果显示,4株PCV2基因组全长均为1767nt,其核苷酸同源性高达99％,与其他北京分离株的同源性也达98％以上,与国内外其他地区PCV2的核苷酸同源性也在95％以上。由此表明,各个PCV2分离株在进化方面存在地域相关性。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.     

猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立

用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。     

广西首例猪圆环病毒3型的发现及其衣壳蛋白序列分析

[目的]明确猪圆环病毒3型(Porcine circovirustype 3,PCV3)在广西猪群中的致病性及流行病学特点,为有效防控其暴发流行提供参考依据.[方法]采用PCR对广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品进行PCV3检测,并对其唯一结构蛋白质(Cap)的结构进行同源模拟,构建遗传进化树;同时在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测Cap蛋白信号肽、糖基化位点和B细胞抗原表位.[结果]在广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品中检测到PCV3.PCR扩增产物经核苷酸序列测定分析后截取Cap基因序列(645 bp),命名为PCV3/CN/Guangxi001/2017.PCV3/CN/Guangxi001/2017与13株国内PCV3毒株和5株美国PCV3毒株的Cap基因序列同源性分别在96.9%~99.4%和98.3%~99.5%,属于3b亚群;而与PCV1毒株和PCV2毒株的核苷酸序列同源性只有43.0%和45.8%,且B细胞抗原表位差异明显,在PCV1特有的B细胞抗原表位(92~103 aa)、PCV2特有的B细胞抗原表位(69~83 aa、117~131 aa和231~233 aa)及PCV1、PCV2共有的B细胞抗原表位(156~162 aa和179~192 aa)均无相似性.[结论]广西猪群中已存在PCV3感染,鉴于PCV2与PCV3间无交叉免疫保护特性,实际生产中应通过加强清洁消毒、灭鼠杀虫、定期监测、自繁自养等生物安全措施防控PCV3暴发流行.     

猪圆环病毒1型北京株全基因组克隆及序列分析

参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从北京一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长为1759bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性为99．4％。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别在97．5％～99．8％和92．7％～100％。虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但仍然呈现出一定的地域相关性。     

猪圆环病毒病的血清学及病原学检测

为贵州猪圆环病毒病的防治提供参考依据,对贵州省花溪区、息烽县和织金县3个地方3个猪场疑似猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)感染发病猪进行临床初步诊断,并分别采集6份血清及组织病料,采用ELISA和PCR技术对18份样品进行PCV2的血清学和病原学检测。结果表明:花溪、息烽、织金3个区(县)的PCV2阳性率分别为33.3%、83.3%和66.7%,3个猪场均出现了PCV2病毒感染,猪圆环病毒贵州流行毒株与Shanghai-06株的亲缘关系最近。