依赖于JA信号的蛋白酶抑制剂介导番茄对斜纹夜蛾的抗性

蛋白酶抑制剂(PI)是番茄防御虫害的重要次生代谢物,茉莉酸(JA)信号在植物抗虫中发挥重要作用.然而,PI和JA在番茄抗虫中的关系与功能尚不明确.以重要鳞翅目害虫斜纹夜蛾、野生型番茄CM、JA突变体spr8和系统素过表达35S∷PS为材料,研究PI和JA在番茄抗虫中的关系与功能.结果表明,与取食对照CM相比,取食35S∷PS的斜纹夜蛾体重增量显著下降,而取食spr8的斜纹夜蛾体重增量显著上升,表明JA信号和系统素都参与了番茄抗虫过程.虫害后CM与35S∷PS中JA合成基因lapA1和pin2表达量显著上调,而spr8中JA合成基因表达量无明显变化,表明番茄抗虫依赖于JA信号.虫害还可以诱导CM合成PI,且35S∷PS中PI含量显著高于CM,spr8中PI含量显著低于CM,说明系统素和JA信号在PI合成中起重要作用.当取食添加PI的饲料时,斜纹夜蛾体重增长率显著下降.以上结果表明番茄受到虫害后通过JA信号调控PI的合成,从而提高对斜纹夜蛾的抗性.     

南方根结线虫在不同茉莉酸含量番茄株系中发育状态观察

【目的】探究内源茉莉酸对番茄中南方根结线虫生长发育的影响。【方法】以番茄野生型株系CM、过量表达前系统素转基因番茄35S∷PS(35S∷prosystemin)和茉莉酸合成缺失突变体spr2为试验材料,采用石蜡切片的方法,观察接种南方根结线虫二龄幼虫(J2)后不同时间各株系内线虫的发育。【结果】接种南方根结线虫J2 5d和7d,CM、35S∷PS和spr2根系中线虫发育无显著差异;接种J2 14d,21d和28d,35S∷PS根系中线虫发育较CM根系中线虫和spr2根系中线虫缓慢。【结论】茉莉酸在一定程度上可以抑制南方根结线虫在番茄中的发育。     

茉莉酸合成相关基因Spr2与LePrs在番茄抗根结线虫中的作用

 【目的】研究茉莉酸合成相关基因Spr2与LePrs对番茄抗根结线虫的影响，探讨茉莉酸在番茄抗根结线虫病中的作用。【方法】以番茄茉莉酸合成突变体spr2、茉莉酸过量表达转基因番茄35S::PS及野生型CM为试材，研究外源喷施茉莉酸甲酯及不同番茄试材相互嫁接对接种根结线虫后番茄根结数、蛋白质酶抑制剂PI-II表达及Spr2、LePrs基因转录水平的影响。【结果】番茄茉莉酸合成突变体spr2较野生型与茉莉酸过量表达转基因番茄35S::PS容易感染根结线虫，外源喷施茉莉酸甲酯降低了番茄根结数。以茉莉酸过量表达转基因番茄35S::PS为砧木，可以提高嫁接植株对根结线虫的抵抗能力。【结论】Spr2突变降低了番茄对根结线虫的抗性， LePrs过量表达可以提高植株对根结线虫的抗性。因此，茉莉酸在番茄抗根结线虫病中起到了一定的作用。     

昆虫取食和机械损伤对棉花和玉米脂氧合酶活性的诱导作用

脂氧合酶(LOX)是植物防御反应中的关键酶,脂氧合酶途径的产物包括茉莉酸、绿叶挥发物等,在植物防御反应中起着重要作用.为了明确脂氧合酶在昆虫取食和机械损伤诱导植物通信中的作用,以棉花、玉米为研究对象,分析不同处理(包括棉蚜取食和机械损伤诱导棉花及其相应挥发物诱导邻近玉米、玉米螟取食和机械损伤诱导玉米及其相应挥发物诱导邻近棉花)的诱导防御机制,测定不同方法处理24、48、72 h后棉花、玉米的脂氧合酶的活性.结果表明,昆虫取食和机械损伤不仅会诱导棉花、玉米植株的LOX活性升高,还能诱导邻近健康植株的LOX活性升高.研究结果表明,脂氧合酶在昆虫取食和机械损伤诱导的棉花、玉米间通信中起作用.     

失水处理诱导番茄中JA相关基因表达的研究

茉莉酸作为一种重要的植物激素,在调控植物对昆虫取食和腐生型病原菌等生物胁迫的抗性反应中具有重要作用。迄今为止,关于茉莉酸调控植物对非生物胁迫抗性的研究较少。以ABA和茉莉酸信号途径中一些番茄突变体为材料,利用荧光定量PCR方法研究失水处理对茉莉酸信号途径中相关标记基因的诱导情况,证明失水处理可诱导茉莉酸信号途径中相关标记基因的表达,这种诱导既依赖于ABA合成,又依赖于茉莉酸合成和信号传导,说明茉莉酸信号途径可能在调控番茄抗旱反应中发挥一定作用。     

TomloxD基因在番茄植株生长发育和果实品质中的功能

[目的]探究TomloxD在番茄植株生长发育和果实品质形成中的功能.[方法]本试验以番茄野生型株系CM、TomloxD过表达株系loxD-oe和TomloxD突变体株系spr8为试材,观察植株的生长情况,分析果实发育过程中品质的变化.[结果]结果表明,TomloxD过表达株系的株高、茎粗和叶片数持续均匀增长,最终株高和叶片数与CM相似,茎粗低于CM;spr8植株的整体生长状态要弱于CM植株.相较于野生型,过表达显著提高了果实的可溶性总糖含量;spr8植株的果实中,维生素C、可溶性总糖、可滴定酸、可溶性蛋白和可溶性固形物的含量均较野生型CM显著增加,平均单果重降低.结果说明,TomloxD基因在番茄植株的生长发育和果实品质形成中有重要的作用.     

番茄受伤反应防御信号的遗传解析

番茄植株受伤诱导的蛋白酶抑制剂(PIs)为研究诱导抗性提供了模型体系,该模型体系可以说明调控系统防御反应信号传导的各种途径。在细胞间,受伤诱导PIs表达的是多肽系统素和氧脂衍生的植物激素茉莉酸,系统素和茉莉酸在同一信号途径中协同作用激活了PIs和其他相关防御基因的表达。     

丛枝菌根菌丝网络介导的番茄植株根系间抗虫系统性信号的传递

利用丛枝菌根真菌摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseae,Fm)在供体与受体番茄根系间建立菌根菌丝网络,研究供体植株叶片被斜纹夜蛾取食诱导产生的抗虫系统防御信号可否通过菌根菌丝网络传递到受体根系,诱导受体植株根系产生防御反应.q-PCR分析表明,预先接种菌根菌Fm的供体植株被斜纹夜蛾取食后,其根系中丙二烯氧化物环化酶基因(AOC)、脂氧合酶基因(LOXD)、蛋白酶抑制剂Ⅰ和Ⅱ基因(PI-Ⅰ和PI-Ⅱ)转录水平显著高于仅被害虫取食和仅接种Fm的处理,以及既未接种Fm又未被害虫取食的对照.同时,与供体有菌根菌丝网络连接的受体植株根系中AOC、LOXD、PI-Ⅰ和PI-Ⅱ转录水平显著高于无菌根菌丝网络连接、菌根菌丝网络连接被阻断,以及有菌根菌丝网络连接但供体植物叶片未被害虫取食的处理,这4个基因最高转录水平分别为无菌丝网络连接对照受体植物的19.5、11.7、9.0、19.0倍.可见,斜纹夜蛾为害叶片可产生系统性防御信号,诱导供体根系产生抗虫防御反应,并且通过菌根菌丝网络将防御信号传递到邻近健康受体番茄根系.     

外源茉莉酸甲酯处理茶树对茶尺蠖幼虫生长的影响

 研究了应用外源茉莉酸甲酯处理茶树后，对茶树叶片中脂氧合酶、多酚氧化酶和蛋白酶抑制素活性，以及对茶尺蠖幼虫中肠蛋白酶活性和生长的影响。结果表明，应用外源茉莉酸甲酯喷雾法或暴露法处理茶树，都能够诱导茶树叶片脂氧合酶、多酚氧化酶和蛋白酶抑制素活性增加，茶尺蠖幼虫中肠强碱性类胰蛋白酶活性和类胰凝乳蛋白酶活性受抑制，但弱碱性类胰蛋白酶活性未受抑制，从而导致茶尺蠖幼虫中肠内各种蛋白酶间的协调性遭到破坏，生长受阻，这可能是茉莉酸甲酯诱导茶树对茶尺蠖幼虫产生直接抗性作用的一种机制。     

转正义基因番茄类囊体膜脂不饱和度对抗旱性的影响

为探讨番茄类囊体膜脂脂肪酸的组成与其抗旱性的关系,以野生型(WT)和转正义LeFAD7基因株系T(+)-12为试材,测定了番茄叶片类囊体膜脂脂肪酸组成,干旱胁迫后的光合参数、叶绿素荧光参数、活性氧清除酶活性和脯氨酸含量的变化。结果表明,转正义基因番茄植株类囊体膜脂中亚麻酸(18∶3)含量升高,亚油酸(18∶2)含量下降,导致膜脂脂肪酸不饱和度升高。与WT相比,干旱胁迫下转正义基因番茄植株的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和光合速率(Pn)下降程度较小,并能维持较高的抗氧化酶活性和脯氨酸含量。类囊体膜脂不饱和度的增加提高了番茄的耐旱性。     

番茄糖转运蛋白SlSTP2在防御细菌性叶斑病中的功能

【背景】近年来,我国番茄生产中面临的不良气候环境导致露地和设施栽培中番茄病害日益严重。由丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）所引发的番茄细菌性叶斑病频发,严重影响了番茄的产量、品质。糖是植物体内重要的信号分子与营养物质,在植物遭受病原菌侵染时,糖既可以作为信号参与调控植物抗病性,也可以作为主要碳源为免疫反应提供能量。STP（sugar transport protein）家族是一类糖转运蛋白家族,在植物生长发育过程与病原防御中起着重要作用。【目的】明确番茄中STP家族是否参与调控植株对细菌性叶斑病的抗性。【方法】以番茄CR品种（Solanum lycopersicum cv. Condine Red）为材料,通过接种Pst DC3000,明确STP基因家族对Pst DC3000的响应。构建SlSTP2的突变材料与过表达材料,并进行鉴定、繁种。在野生型和SlSTP2基因突变体、过表达植株上接种Pst DC3000,观察比较叶片发病情况、台盼蓝染色显示的死细胞数量,检测叶片菌落数（colony-forming units,CFU）和光系统II实际光化学效率,明确SlSTP2在植株防御细菌性叶斑病中的作用。为探究SlSTP2防御Pst DC3000的内在分子机制,通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complimentary,BiFC）试验筛选互作蛋白,构建编码该蛋白的基因突变与过表达材料,并接种Pst DC3000明确其在植株防御细菌性叶斑病中的作用。【结果】在番茄植株上接种Pst DC3000后,SlSTP1和SlSTP2表达上调,选取上调最显著的SlSTP2作为后续研究对象,构建其突变材料与过表达材料。在番茄野生型和Slstp2突变植株、OE:SlSTP2过表达植株上接种Pst DC3000,相比野生型植株,Slstp2植株细菌性叶斑病的发病情况更严重,叶片CFU与台盼蓝染色显示出的死细胞数均更多,光系统II实际光化学效率下降,OE:SlSTP2植株则相反。通过BiFC试验发现,SlSTP2与G蛋白β亚基SlAGB1互作。接种Pst DC3000后,Slagb1突变体发病较野生型重,呈现与Slstp2突变体一致的发病表型;OE:SlAGB1则与OE:SlSTP2植株同样表现出更强的抗性。【结论】SlSTP2受Pst DC3000诱导,并正调控番茄对细菌性叶斑病的抗性,且SlSTP2与正调控因子SlAGB1互作,推测SlSTP2调控番茄细菌性叶斑病抗性与SlAGB1有关。     

一种新型降钙素基因相关肽基因转化番茄的研究

按植物偏爱密码子设计合成一种新型降钙素基因相关肽基因(mcgrp),构建植物双元表达载体p35S-2300:: mcgrp::noster,通过农杆菌介导法转化番茄,获得卡那霉素抗性植株27株;经PCR和Southern blot检测有2株为独立的转基因阳性苗,阳性率为7．4%;通过RT-PCR检测,证实外源基因mcgrp在转基因番茄中成功表达(转录水平)。该研究为进一步利用植物系统表达降钙素基因相关肽研究做必要准备。     

茉莉酸介导的番茄韧皮部表达谱对根结线虫侵染的响应

为了研究茉莉酸介导的基因对根结线虫侵染的响应,以番茄野生型和茉莉酸缺失突变体为试材,采用数字表达谱技术检测分析根结线虫侵染后主茎韧皮部中的差异表达基因。结果表明,茉莉酸缺失突变体中有2 427个基因差异表达,其中1 390个差异基因可富集到112个KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路。18个差异基因涉及茉莉酸合成前体α-亚麻酸代谢,100个差异基因参与植物和病原体的相互作用。     

外源茉莉酸对菜豆和番茄幼苗3种防御酶的诱导效应

为明确外源茉莉酸（JA）对菜豆和番茄化学防御的诱导作用,以鲁阳地豆菜豆和红珍珠番茄为材料,研究4种浓度（0.001、0.01、0.1和1 mmol/L）JA喷施2种植物幼苗后叶片多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD) 和脂氧合酶(LOX)的活性变化。结果表明,JA处理可以提高菜豆和番茄叶片3种防御酶的活性,活性提高与诱导的JA浓度和诱导时间有关。0.001 mmol/L JA对菜豆叶片3种防御酶诱导作用不明显,0.1 mmol/L JA诱导效果均显著。4种JA浓度对番茄叶片POD和PPO均具有显著的诱导作用,但0.001和1 mmol/L JA对LOX诱导效果不明显。0.1 mmol/L JA处理72 h后对番茄叶片LOX诱导作用最强,但处理24 h后对番茄叶片POD和PPO以及菜豆叶片3种防御酶诱导作用最强。     

转CiNPR4基因柑橘抗溃疡病的机制解析

【目的】病程相关基因非表达子1（non-expressor of pathogenesis-related gene 1,NPR1）是水杨酸（salicylic acid,SA）介导的系统获得性抗性信号转导途径中一个重要的转录因子,在调节植物的抗病方面发挥着关键性的作用。研究耐黄龙病的‘Jackson’葡萄柚（Citrus paradisi）中的NPR1-like基因CiNPR4对柑橘溃疡病的抗性,解析过表达CiNPR4的转基因晚锦橙（C. sinensis）抗柑橘溃疡病的机理。【方法】选取黄龙病抗性增强的CiNPR4转基因柑橘,采取完全成熟的叶片利用针刺法进行柑橘溃疡病的离体抗性评价分析;在此基础上,对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株利用针刺法离体接种溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）,统计接种Xcc后0、1、3、5、7和9 d的细菌数量;利用注射法对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片接种Xcc,接种后0、3和5 d收集接种部位的叶片,测定叶片中SA和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量;同时,收集接种Xcc后0、3和5 d接种部位的叶片,利用实时荧光定量 PCR分析SA和JA分别介导的防御反应相关基因CsPR1和CsPDF1.2在Xcc诱导下表达水平的变化;根据CiNPR4蛋白与TGA转录因子相互作用网络预测CiNPR4互作蛋白为Ciclev10005080m和Ciclev10001081m,以甜橙为参考基因组,将这两个基因在https://www.citrusgenomedb.org/网站上进行blastx分析,预测CiNPR4在甜橙基因组中互作的候选蛋白,克隆CiNPR4和候选蛋白基因的cDNA,利用同源重组法分别构建诱饵载体和猎物载体,并将诱饵质粒和猎物质粒共转入酵母菌株Y2HGold中,进行点对点酵母双杂交分析。【结果】CiNPR4的超量表达减轻了转基因柑橘叶片上溃疡病的症状,柑橘溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片上Xcc的生长比较缓慢,在接种Xcc后9 d,转基因植株Xcc数量显著低于野生型（wild type,WT）晚锦橙;Xcc诱导0 d,溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株含有与WT植株无差异的SA含量,随着Xcc诱导时间的延长,CiNPR4转基因植株中SA的含量显著增加;而Xcc处理0 d时,WT植株含有显著高于CiNPR4转基因植株的JA含量,随后,JA含量在CiNPR4转基因植株中逐步上升,Xcc处理5 d时,达到显著高于WT植株的水平;而WT植株在整个处理期间SA和JA的含量基本保持不变;溃疡病抗性增强的转基因植株受Xcc诱导3 d时CsPR1的表达水平迅速上升,达到与WT植株差异显著的水平,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升;WT植株受Xcc诱导后CsPR1的表达水平没有发生显著变化,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升,且显著高于CiNPR4转基因植株中CsPDF1.2的表达水平;酵母双杂交分析证实,CiNPR4与甜橙基因组中的CsTGA2转录因子互作。【结论】CiNPR4与CsTGA2转录因子互作,通过促进SA而抑制JA介导的防御反应,调控转基因柑橘对溃疡病的抗性。     

亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制

【背景】灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是危害番茄（Solanum lycopersicum）的重要病害之一,防治不及时可造成30%—40%减产。目前生产上多以化学防治为主,但存在农产品安全及环境污染的风险。N-酰基乙醇胺（NAE）是植物体内天然存在的一类脂质生物活性化合物,其在哺乳动物中具有多种免疫功能,但其在植物免疫中的作用和机制尚不清楚。【目的】探讨N-酰基乙醇胺在诱导番茄对灰葡萄孢防御中的作用,为研发番茄灰霉病绿色防控技术提供依据。【方法】将灰葡萄孢分别接种在含有硬脂酰乙醇胺（NAE 18:0）、亚油酸乙醇胺（NAE 18:2）、廿二碳五烯酸乙醇胺（NAE 22:5）的培养基上,观察灰葡萄孢的生长情况。在此基础上,以番茄‘Moneymaker’植株为材料,硬脂酰乙醇胺、亚油酸乙醇胺、廿二碳五烯酸乙醇胺外源处理番茄叶片后接种灰葡萄孢,统计病情指数,测定荧光参数。采用qRT-PCR技术明确亚油酸乙酰胺处理后番茄叶片灰葡萄孢Actin的相对表达量,进一步测定番茄叶片中主要抗病基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1、PYR1a等的相对表达量及茉莉酸（jasmonic acid,JA）、水杨酸（salicylic acid,SA）、乙烯（ethylene,ETH）、脱落酸（abscisic acid,ABA）、生长素（indoleacetic acid,IAA）含量。并以乙烯信号转导突变体植株never ripe（nr）及对照植株Pearson（PB）为材料,在外源亚油酸乙酰胺处理后接种灰葡萄孢,测定番茄叶片叶绿素荧光参数和灰葡萄孢Actin的相对表达量。【结果】体外培养试验结果表明灰葡萄孢生长并不受外源N-酰基乙醇胺的影响,外源施用N-酰基乙醇胺能显著提高番茄植株对灰霉病的抗性,缓解由灰葡萄孢侵染导致的番茄叶片光系统II实际光化学效率（Φ_PSII）的下降。3种N-酰基乙醇胺中,亚油酸乙醇胺施用后番茄叶片灰霉病病情指数下降最为明显,灰葡萄孢Actin的相对表达量下调60%,其诱导灰霉病抗性效果最佳。番茄植株接种灰葡萄孢后抗性基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1的表达水平均有不同程度上调。外源亚油酸乙醇胺处理使得番茄响应灰葡萄孢接种后PI I、Nr、ACO1的表达进一步增强,其中乙烯合成基因ACO1的表达水平最高。番茄植株接种灰葡萄孢后叶片水杨酸、茉莉酸、生长素和乙烯含量增加,但外源亚油酸乙醇胺处理并接种灰葡萄孢后只有乙烯含量显著增加。进一步研究发现,番茄乙烯突变体nr植株中,外源亚油酸乙醇胺对灰葡萄孢的抗性诱导作用显著受到抑制。【结论】外源施用亚油酸乙醇胺能够提高番茄内源光合效率和抗病基因的表达及内源激素乙烯的含量,增强番茄植株对灰霉病的抗性,推测其诱导抗性作用可能与乙烯信号路径相关。     

LeWRKY2基因的克隆及功能分析

【目的】克隆番茄WRKY2转录因子,为研究番茄抗病反应的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】根据克隆出的番茄LeWRKY2基因特异片段（GenBank登录号：EU755368.1）,运用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cNDA ends,RACE）技术克隆番茄LeWRKY2 cDNA全长,并用生物信息学的方法对其进行分析。用实时荧光定量PCR方法检测番茄经JA、番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、放线菌酮（cycloheximide）刺激时LeWRKY2基因的表达情况。【结果】①从番茄中克隆到一条全长为1 007 bp的cDNA序列,命名为LeWRKY2基因,阅读框471 bp,编码156个氨基酸。②LeWRKY2蛋白含有1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构,可能具有转录、转录调控、信号传导功能。③100 μmol•L-1 茉莉酸（jasmonic acid,JA）刺激番茄幼苗0-60 min时,LeWRKY2基因的相对含量与JA刺激时间成正比;而刺激60-150 min时,LeWRKY2基因的相对含量与JA刺激时间成反比;④番茄灰霉菌可以诱导LeWRKY2基因的的表达,且在4 h时表达量达到最高;⑤LeWRKY2基因的转录产物的合成不依赖于蛋白质的从头合成。【结论】LeWRKY2是一种参与番茄防御反应的早期快速反应基因。