CMV侵染胁迫下黄瓜重要功能基因表达及代谢响应的研究

 【目的】研究黄瓜花叶病毒病（CMV）侵染胁迫下黄瓜重要功能基因表达和代谢途径响应。【方法】在结合气体交换和叶绿素荧光参数及抗性相关酶活性测定的基础上， 应用农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室自主开发的黄瓜cDNA芯片研究黄瓜在CMV侵染胁迫下的基因表达谱变化，并对其中5个具有代表性的基因通过实时荧光定量PCR（QRT—PCR）进行检测，以验证cDNA芯片杂交结果的可靠性。【结果】共获得67个差异表达显著的基因，其中42个基因下调表达，25个基因上调表达。这些差异表达的基因涉及了许多重要代谢途径。许多与光合作用、氮同化相关的基因受到明显的抑制；而一些防御相关基因和信号传导相关基因则诱导表达；同时，也发现了一些与CMV胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。【结论】CMV胁迫引发了黄瓜代谢发生一系列复杂的适应性变化，PR1-1a等基因可能在黄瓜防御CMV侵染过程发挥着重要作用。     

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO₂浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶（β- carbonic anhydrase,βCA）是植物CO₂感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄（Solanum lycopersicum）等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network 数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型（wild-type,WT）番茄‘Ailsa Craig’（AC）为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000）,利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株（OE-SlβCA3）。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2 100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工（糖基化）,氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。     

光质对黄瓜叶片衰老与抗氧化酶系统的影响

【目的】明确不同光质对黄瓜叶片衰老的作用及其机制。【方法】以黄瓜为材料,研究白光(W)、紫光(P)、蓝光(B)、绿光(G)、黄光(Y)和红光(R)等不同光质对叶片叶绿素、可溶性蛋白及丙二醛(MDA)的含量和CAT、G-POD、APX等抗氧化酶的活性及基因表达的影响。【结果】紫光和蓝光诱导了抗氧化酶基因的表达及活性的上升,延缓了叶绿素和可溶性蛋白含量的下降,并且使MDA的含量保持相对较低的水平,从而延缓了植株的衰老。绿光、黄光和红光则抑制了抗氧化酶的活性,导致黄瓜植株叶绿素和可溶性蛋白含量的不断下降及MDA含量的持续上升,加速了植株的衰老进程。【结论】紫光和蓝光可以使叶片维持较高的抗氧化酶水平,从而延缓了植株的衰老。     

芸薹属两个亚种间杂种光合作用优势及其机理

 【目的】探讨芸薹属作物杂种是否具有光合作用优势及其机理。【方法】利用气体交换和叶绿素荧光技术系统地研究了‘矮脚黄’白菜和‘白蔓菁’芜菁及其正反交杂种的叶片光合作用的特性，并对卡尔文循环中的关键酶核酮糖1，5-二磷酸羧化/加氧酶（RuBisCO）进行了相对定量研究。【结果】在整个试验期间，杂种F1的净光合速率（Pn）显著高于双亲，具有较强的杂种优势。杂种气孔导度（Gs）也高于亲本，但其胞间CO2浓度（Ci）和气孔限制值（l）与亲本间没有明显的差异。杂种总叶绿素含量介于双亲之间，仅表现出微弱的中亲优势。杂种PSII光合电子传递量子效率（ΦPSII）及光合电子传递速率（ETR）显著高于亲本，其变化趋势和PSII反应中心开放程度（qP）一致。RuBisCO最大羧化速率（Vcmax）、最大电子传递速率（Jmax）和RuBisCO蛋白含量在杂种中均有所增加。【结论】气孔导度、叶绿素含量和光呼吸均不是杂种光合优势产生的主要原因。光合优势的产生很可能是由于碳固定效率的增加反馈上调了光合电子传递速率引起的。     

低温弱光对黄瓜幼苗地上部和根系生长与呼吸作用的影响

以冷敏感作物黄瓜(Cucumis sativus)为材料,研究低温弱光(100μmol/m2.s-1、8℃)对黄瓜幼苗地上部及根系生长与呼吸作用的影响。结果表明:低温弱光抑制了黄瓜幼苗地上部与根系的生长,并导致根冠比由0.17增加为0.26。叶片总呼吸(Vt)、细胞色素呼吸(ρ’Vcyt)和抗氰呼吸(ρValt)在胁迫初期瞬间急剧增强,后随处理时间延长又迅速下降,其中Vt和ρ’Vcyt低于对照水平,但ρValt仍与对照水平相当;低温弱光虽然降低了根系ρ’Vcyt,但诱导ρValt显著增强,最终导致Vt增加;低温弱光下根系ρValt/Vt的增加程度明显高于叶片。低温弱光下叶片线粒体呼吸控制率下降程度大于根系,说明低温弱光对叶片线粒体的伤害大于根系。     

根系限制对番茄幼苗生长、根系呼吸、ATPase和PPase活性的影响

 采用营养液水培的方式, 研究了根系限制处理对番茄幼苗生长、根系呼吸、质膜和液泡膜上相关酶以及根尖细胞超微结构的影响。结果表明, 在处理初期, 根系限制促进了番茄幼苗根系细胞色素途径呼吸而抑制了交替途径呼吸; 而在后期, 根系限制处理显著地抑制了番茄植株的生长, 对根系的生长抑制更为明显, 且抑制过程伴随着根系总呼吸、细胞色素途径呼吸的降低。此外, 根系限制显著抑制了质膜H⁺ -ATPase, 液泡膜H⁺-ATPase和H⁺ -PPase的活性并导致根尖细胞核的解体。     

亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制

【背景】灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是危害番茄（Solanum lycopersicum）的重要病害之一,防治不及时可造成30%—40%减产。目前生产上多以化学防治为主,但存在农产品安全及环境污染的风险。N-酰基乙醇胺（NAE）是植物体内天然存在的一类脂质生物活性化合物,其在哺乳动物中具有多种免疫功能,但其在植物免疫中的作用和机制尚不清楚。【目的】探讨N-酰基乙醇胺在诱导番茄对灰葡萄孢防御中的作用,为研发番茄灰霉病绿色防控技术提供依据。【方法】将灰葡萄孢分别接种在含有硬脂酰乙醇胺（NAE 18:0）、亚油酸乙醇胺（NAE 18:2）、廿二碳五烯酸乙醇胺（NAE 22:5）的培养基上,观察灰葡萄孢的生长情况。在此基础上,以番茄‘Moneymaker’植株为材料,硬脂酰乙醇胺、亚油酸乙醇胺、廿二碳五烯酸乙醇胺外源处理番茄叶片后接种灰葡萄孢,统计病情指数,测定荧光参数。采用qRT-PCR技术明确亚油酸乙酰胺处理后番茄叶片灰葡萄孢Actin的相对表达量,进一步测定番茄叶片中主要抗病基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1、PYR1a等的相对表达量及茉莉酸（jasmonic acid,JA）、水杨酸（salicylic acid,SA）、乙烯（ethylene,ETH）、脱落酸（abscisic acid,ABA）、生长素（indoleacetic acid,IAA）含量。并以乙烯信号转导突变体植株never ripe（nr）及对照植株Pearson（PB）为材料,在外源亚油酸乙酰胺处理后接种灰葡萄孢,测定番茄叶片叶绿素荧光参数和灰葡萄孢Actin的相对表达量。【结果】体外培养试验结果表明灰葡萄孢生长并不受外源N-酰基乙醇胺的影响,外源施用N-酰基乙醇胺能显著提高番茄植株对灰霉病的抗性,缓解由灰葡萄孢侵染导致的番茄叶片光系统II实际光化学效率（Φ_PSII）的下降。3种N-酰基乙醇胺中,亚油酸乙醇胺施用后番茄叶片灰霉病病情指数下降最为明显,灰葡萄孢Actin的相对表达量下调60%,其诱导灰霉病抗性效果最佳。番茄植株接种灰葡萄孢后抗性基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1的表达水平均有不同程度上调。外源亚油酸乙醇胺处理使得番茄响应灰葡萄孢接种后PI I、Nr、ACO1的表达进一步增强,其中乙烯合成基因ACO1的表达水平最高。番茄植株接种灰葡萄孢后叶片水杨酸、茉莉酸、生长素和乙烯含量增加,但外源亚油酸乙醇胺处理并接种灰葡萄孢后只有乙烯含量显著增加。进一步研究发现,番茄乙烯突变体nr植株中,外源亚油酸乙醇胺对灰葡萄孢的抗性诱导作用显著受到抑制。【结论】外源施用亚油酸乙醇胺能够提高番茄内源光合效率和抗病基因的表达及内源激素乙烯的含量,增强番茄植株对灰霉病的抗性,推测其诱导抗性作用可能与乙烯信号路径相关。     

腐胺提高黄瓜根际低氧耐性的生理机理

 【目的】明确腐胺（putrescine，Put）对黄瓜根际低氧耐性的作用及其机制。【方法】以黄瓜为材料，分别在抑制和不抑制酸还原过程的条件下，在水培体系中对植物进行Put和根际低氧胁迫处理。【结果】外源Put显著提高了硝酸还原酶的实际（NRact）和最大（NRmax）活性，且这种作用在低氧胁迫植株中表现尤为明显。Put缓解了低氧胁迫下黄瓜叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）以及根系线粒体总呼吸（Vt）、细胞色素途径呼吸（Vcyt）和交替途径呼吸（Valt）速率的下调。然而，当硝酸还原过程被钨酸钠抑制后，Put不仅失去了对光合作用及线粒体呼吸的缓解作用，反而进一步加剧了这两个基础代谢过程活性的下降。【结论】Put参与提高黄瓜对低氧胁迫抗性的作用和硝酸还原过程有关。     

番茄转录因子SlNAC29在调控植株衰老中的作用及机理

【背景】番茄（Solanum lycopersicum）作为连续发芽分化和坐果的重要园艺作物,早衰是限制其生长期长短、产量和品质的重要因素。NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）转录因子家族参与调控拟南芥、水稻等多种植物衰老进程,但在番茄中的研究尚不深入。目前已知,SlNAP2（NAC-like, activated by apetala3/pistillata）参与番茄植株衰老进程。【目的】SlNAC29为SlNAP2的同源基因,对其在番茄植株衰老中的功能及调控机制进行研究,以期为园艺栽培中番茄的衰老调控及种质创新提供科学依据。【方法】以野生型番茄（Condine Red,CR）为背景,采用qRT-PCR技术明确SlNAC29在不同衰老阶段叶片中的相对表达量,并分别利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因过表达技术构建Slnac29纯合突变体及OE: SlNAC29稳定过表达植株。在此基础上,在自然生长状态下和黑暗处理诱导衰老条件下,对野生型、Slnac29突变体和OE:SlNAC29过表达植株的生长、叶绿素含量、光合作用、叶片衰老和叶绿素降解相关基因的相对表达量等参数进行分析,明确SlNAC29转录因子在调控番茄植株衰老中的生物学功能;进一步利用聚类热图分析过表达植株OE: SlNAC29中29个衰老相关基因、叶绿素降解基因以及ABA合成/信号转导相关基因的相对表达量。并选取在黑暗诱导衰老条件下不同株系植株中表达差异明显的4个基因进行凝胶迁移阻滞分析（electrophoretic mobility shift analysis,EMSA）,以鉴定SlNAC29直接转录调控的靶标基因及其与衰老调控的关系。【结果】SlNAC29在初老叶和衰老叶片中的相对表达量较嫩叶和成熟叶显著上升。自然生长状态下,突变体材料Slnac29与野生型长势以及光合速率无明显差异,而过表达材料OE: SlNAC29株高则显著低于野生型植株,叶绿素含量和光合速率分别是野生型植株的25%和50%。在黑暗诱导衰老的条件下,野生型植株叶片明显变黄,叶绿素含量显著下降。Slnac29突变缓解了叶片衰老程度,叶片无明显变黄,叶绿素含量是野生型的3倍,衰老相关基因（senescence-associated genes,SAGs）和叶绿素降解基因的表达量均较低。OE: SlNAC29则相反,叶片衰老程度比野生型和Slnac29突变体均明显严重。基因聚类分析表明多个衰老相关基因和叶绿素降解基因在OE: SlNAC29植株中显著上调表达。EMSA鉴定到SlNAC29能够直接与衰老相关基因家族SAGs成员SlAGT1（Glyoxylate aminotransferase）启动子绑定,且SlAGT1在OE: SlNAC29中的相对表达量较野生型和Slnac29突变体显著增加。【结论】转录因子SlNAC29调控番茄植株的衰老,促进番茄叶片在黑暗诱导条件下的衰老进程。SlNAC29直接绑定衰老相关基因SlAGT1启动子区域调控其转录表达。     

模拟酸雨对番茄光合作用和病害发生的影响及油菜素内酯对其缓解效应

【目的】在全球气候变化大背景下,酸雨沉降日益加剧,严重影响蔬菜等农作物的产量、品质和抗性。油菜素内酯（brassinosteroid,BR）是一类植物体中广泛存在的植物激素,具有广谱调控植物抗性的作用。研究外源油菜素内酯对模拟酸雨环境下蔬菜作物光合作用和病害发生的影响,明确其对酸雨条件下蔬菜危害的缓解效应,对蔬菜作物安全生产提供指导。【方法】本研究以番茄（Solanum lycopersium L.）‘合作903’为材料,在模拟酸雨（模拟酸雨1（simulated acid rain 1,SiAR1）：NH₄NO₃（1.3 g·L^-1）、MgSO₄·7H₂O（3.1 g·L^-1）、Na₂SO₄（2.5 g·L^-1）、KHCO₃（1.3 g·L^-1）、CaCl₂·2H₂O（3.1 g·L^-1）,用1 N H₂SO₄调节pH至3.0;模拟酸雨2（SiAR2）：杭州地区春季收集的雨水,pH调至3.0）和对照（喷施dH₂O）条件下研究酸雨对番茄叶片光合作用和Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）引发的细菌性叶斑病发生的影响,其次在模拟酸雨和对照条件下对番茄叶片外源施用BR,研究外源施用BR对番茄叶片的光合特性和细菌性叶斑病发生的缓解作用,为了研究BR缓解作用的内在机制,测定番茄叶片光合作用关键基因FBPase、SBPase、rbcS和抗病基因PR1、NPR1的表达以及抗氧化酶的活性。【结果】模拟酸雨导致番茄叶片净光合作用速率（Pn）、光系统II实际光化学效率（Φ_PSII）及光化学淬灭系数（qP）显著下降;模拟酸雨削弱了番茄对Pst DC3000的抗性,导致细菌性叶斑病发病率上升和菌落数显著增加。外源施用BR提高酸雨和对照条件下番茄叶片的光合作用,并有效增强了酸雨条件下番茄对Pst DC3000的抗性,使酸雨条件下叶片菌落数下降,光系统II实际光化学效率提高。探究BR缓解效应的内在机制发现,外源施用BR显著提高了番茄叶片光合作用关键基因FBPase、SBPase、rbcS和抗病基因PR1、NPR1等的表达,降低了膜脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量,并增加了愈创木酚过氧化物酶（G-POD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性,从而缓解模拟酸雨对番茄光合和抗病性的抑制作用。【结论】外源施用BR能够显著提高番茄内源光合相关基因和抗病基因的表达及抗氧化酶的活性,有效促进酸雨环境中番茄等园艺作物的生长和增强抗病性。