细菌性条斑病菌JH01诱导水稻抗病均一化差减文库的构建

[目的]构建细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减c DNA文库,对获得的差异表达ESTs进行生物信息学及抗病相关基因的表达分析。[方法]以水稻IR26(Tester)和两优培九(Driver)幼苗5~6叶期叶片为材料,采用双链特异性核酸酶(DSN)介导的均一化消减杂交技术,构建细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻抗病相关基因差减c DNA文库,以p LB-F和p LB-R为引物,通过菌液PCR扩增对差减文库的质量进行检测。[结果]c DNA文库的插入片段分布在0.5~2.0 kb,平均大小约为1.0 kb,重组率达95%。序列测定分析发现,随机挑取的504个克隆中有98条差异表达基因;经BLAST比对和GO注释发现,59条序列具有同源基因,分别参与信号转导、能量代谢、过敏性坏死反应、防卫反应等;另外39条序列无相似基因,有待进一步研究。通过实时荧光定量PCR发现,从该文库中分离得到的Os NDPK4参与细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。[结论]水稻受细菌性条斑病菌侵染的c DNA文库质量较好,为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定基础。     

水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系的建立

水稻细茵性条斑病菌存在至少20个avrBs3/pthA家族成员,但其在水稻上的毒性或无毒性贡献并不清楚.本文依据avrBs3/pthA结构上的保守性,利用同源重组策略,借助自杀性载体pKMS1介导,对水稻条斑病菌中的avrBs3/pthA家族基因进行敲除.结果发现:同源交换可通过基因内和基因间重组实现avrBs3/pthA家族的基因敲除;PCR和Southern杂交结果显示,水稻条斑病菌中有5个avrB5s3/pthA家族基因被成功敲除,表明水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系构建成功.这为逐一评价avrBs3/pthA 家族基因的毒性或/和无毒性功能奠定了基础.     

稻曲病菌侵染水稻颖花的酵母双杂交cDNA文库构建与应用

【目的】近年来稻曲病日益严重,但目前对稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)与水稻相互作用机制仍不清楚。论文旨在利用水稻感病颖花材料构建酵母双杂交文库并筛选稻曲病菌效应因子互作蛋白,为解析稻曲病菌侵染水稻机制提供理论基础。【方法】以感病水稻Chuannong H2S为试验材料,在水稻破口前5—7 d左右,从水稻穗中上部接种PSB摇培7 d的稻曲病菌荧光标记菌株P4,接种13 d后取颖花进行激光共聚焦观察,收集感病颖花。提取感病颖花总RNA,使用含有Oligo(dT)的接头引物反转录cDNA第一链,并PCR扩增ds cDNA,通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收ds cDNA片段,与载体p GADT7-Rec进行同源重组,转化酵母菌株Y187构建酵母双杂交cDNA文库。然后用稻曲病菌效应因子Uv_1261基因构建诱饵载体,将诱饵载体转化入Y2HGold酵母菌株,通过酵母双杂交自激活验证后以该诱饵载体筛选酵母双杂交文库,最终在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上筛选出生长状况良好的蓝色单菌落,经测序得到候选互作蛋白的序列,通过NCBI在线网站进行Blast分析和Uniprot在线网站进行gene ontology(GO)注释。【结果】经检测,文库滴度为5.7×108 cfu/mL,平均插入片段大小为750 bp,表明稻曲病菌侵染水稻颖花cDNA文库质量较高。用Uv_1261构建诱饵载体,转化Y2HGold后,转化菌可在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长,不能在SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A平板上生长,表明Uv_1261无自激活现象。以该诱饵载体筛选文库,对筛选到的候选互作蛋白进行测序验证并Blast分析获得了56个来自稻曲病菌或水稻的候选互作蛋白,其中有28个候选互作蛋白来自稻曲病菌,有16个来自水稻,以及12个未知蛋白。经GO注释显示,来自稻曲病菌中的候选互作蛋白参与了17个生物过程,包括翻译、代谢过程、氧化还原及胞内氨基酸合成等;分子功能包括金属离子结合活性、水解酶活性及ATP结合活性等;细胞组分包括核糖体、细胞质及线粒体等。来自水稻中的候选互作蛋白参与了11个生物过程,包括蛋白质去磷酸化、糖代谢及翻译等;分子功能包括金属离子结合活性、核苷酸结合活性及转移酶活性等;细胞组分包括核糖体、膜及细胞核等。【结论】该cDNA文库质量较好,能成功地用于稻曲病菌效应蛋白的互作蛋白筛选,可为研究稻曲病菌与水稻相互作用的分子机制提供重要资源。     

烟草和水稻中水稻条斑病菌过敏反应激发子Ssb_x互作因子的鉴定

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)中单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SsbX)通过病原菌III型分泌系统(type-III secretion system,T3SS)分泌,在非寄主植物烟草上产生过敏反应(hypersensitive response,HR),研究旨在明确SsbX激发烟草产生HR的机理。【方法】将水稻条斑病菌RS105菌株注射水稻和烟草叶片,应用CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建水稻和烟草cDNA文库,借助pGADT-Sfi AB载体上特殊酶切位点SfiⅠ,酶切检测水稻和烟草cDNA文库质量;以SsbX为诱饵,通过酵母双杂交技术(Y2H)从水稻和烟草cDNA文库中筛选在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His培养基上能够生长的阳性克隆;并利用β-gal试验验证阳性克隆;序列测定后,使用MEGA 4序列分析软件,并利用邻位相连法(neighbor-joining,NJ)对筛选获得的互作因子进行同源序列和系统进化树分析;利用荧光双分子互补试验(BiFC)于488 nm处黄色激发光和520—550 nm透射光、20×物镜下,在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5-II)观察SsbX与烟草和水稻中互作因子的互作位点。【结果】水稻和烟草cDNA文库构建和质量检测结果显示,随机挑选20个克隆中水稻来源的cDNA插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.0kb;随机挑选20个克隆中烟草来源的cDNA均插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.2 kb,说明水稻和烟草的cDNA文库构建质量较好;Y2H和β-gal试验结果显示,SsbX可与烟草和水稻的ADF2(actin-depolymerization factor 2)蛋白互作,使酵母AH109能够在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His平板上生长,并且β-gal染色显示为蓝色。水稻Os ADF2编码139氨基酸,蛋白质分子量为15.9 k D,而烟草Nb ADF2编码137氨基酸,蛋白质分子量为15.kD,两者同源性达69.02%。同源性以及系统进化树分析显示,植物中ADF2广泛存在,同源性高达60%以上。双子叶植物烟草和拟南芥的ADF2同源性最高,相似性达69.05%;单子叶禾本科植物水稻和狗尾草的ADF2同源性最高,相似性为88.81%。BiFC试验结果显示,在488 nm波长的激光共聚焦显微镜下,仅SsbX和Os ADF2以及SsbX和Nb ADF2共同存在时,可在烟草细胞膜上显示黄色荧光,与阳性对照显示黄色荧光一致,说明SsbX可与Os ADF2或Nb ADF2互作,互作位点发生在植物细胞膜上。【结论】通过T3SS分泌的水稻条斑病菌中的SsbX,在植物细胞膜上与ADF2互作,从而激发植物的免疫性。这为进一步揭示SsbX如何激发植物产生HR的机制提供了依据。     

细菌性条斑病侵染水稻抗性相关蛋白研究

水稻细菌性条斑病由Xanthomonas oryzae pv. oryzicola引起,是目前威胁亚洲稻区水稻生产的重要病害之一。以水稻品种9311为研究对象, 通过差异蛋白质组学方法,研究了病菌侵染48 h后水稻叶片的差异表达蛋白质,通过分析比对、质谱分析以及数据库检索,从中选择了7个上调表达的鉴定蛋白,包括4个水稻LRK类基因,2个NBS-LRR 类基因和1个PR-10基因家族成员基因。并设计相应的PCR引物,从水稻cDNA 中获得相关基因片段做探针进行Northern杂交分析,结果显示,上述基因在接种病原菌12 h或48 h后表达量增加,表明这些蛋白质参与了抗病反应。     

水稻病程相关蛋白基因OsPR-4b启动子的克隆及缺失体构建

用一对根据已克隆的水稻OsPR-4b基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列设计的引物扩增到OsPR-4b基因上游2257 bp的启动子序列.用PLACE软件分析顺式作用元件,发现OsPR-4b基因起始密码子上游1.5kb的区域内存在几个可能与PR蛋白基因表达调控相关顺式作用元件,如W盒、PAL-boxA、GT-1结合序列、Dof结合序列和MybSt1元件等.将OsPR-4b基因启动子区域及其5'部分缺失构件与gus报道基因相连,并克隆进pCAMBIA1391z载体中,用于分析启动子活性以及顺式作用元件在调控OsPR-4b基因表达中的功能.     

黄瓜子叶细菌性果斑病菌侵染初期cDNA文库的构建及质量评价

[目的]构建黄瓜子叶细菌性果斑病菌侵染初期的cDNA文库,研究细菌性果斑病菌与黄瓜相互作用的分子机制奠定基础.[方法]以接种细菌性果斑病菌4d的Chinese long品种自交系9930黄瓜子叶为材料,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,利用同源重组的方法将双链cDNA转移到酵母双杂交载体pGADT中,获得cDNA文库,对该文库质量进行分析.[结果]提取的黄瓜子叶总RNA电泳检测出3条特异性条带,分离纯化的mRNA电泳检测呈弥散条带;反转录合成的双链cDNA电泳条带呈弥散状均匀分布,大小分布在850 ～4 000 bp;黄瓜子叶cDNA文库的库容量达2.2×106 CFU/mL,文库重组率为95.8;,文库插入片段的平均长度在1.5kb左右,达到了标准cDNA文库的要求.[结论]所获得的文库质量较高,可以用于进行与功能蛋白相互作用的筛选及研究细菌性果斑病菌与黄瓜相互作用的分子机制.     

4株拮抗细菌与链霉素、叶枯唑协同控制水稻细菌性条斑病研究

研究了4株拮抗细菌对细菌性条斑病菌的抑制活性和6种化学药剂对细菌性条斑病菌的毒力,探讨了它们协同控制水稻细菌性条斑病的效果.结果表明,叶枯唑和链霉素对水稻细菌性条斑病菌具有较强的抑制作用,杀真菌剂苯醚甲环唑、丙环唑对水稻细菌性条斑病具有较好的杀菌活性;4株拮抗细菌对细菌性条斑病菌均有较强的抑制能力,其中X-35对细菌性条斑病菌的抑制效果最为明显,抑菌圈面积为804.3 mm2,B-916、X-1、X-10的抑菌圈面积分别为675.6、522.0、755.9 mm2.上述4株拮抗细菌与链霉素、叶枯唑具有较好的相容性,在500 μg/mL链霉素、500 μg/mL叶枯唑时,4株拮抗细菌均可正常生长;4株拮抗细菌分别与链霉素、叶枯唑混配后,对水稻细菌性条斑病具有较好的防治效果,其中拮抗细菌B-916、X-10与链霉素混配后,均比单用化学农药的防治效果好,提示拮抗细菌B-916、X-10可以部分替代链霉素、叶枯唑用于防治水稻细菌性条斑病.     

一株拮抗水稻条斑病菌的蜡样芽孢杆菌的分离和鉴定

水稻条斑病菌(Xanthomolias oryzae pv.oryzicola,Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak,简称BLS),严重威胁水稻的安全生产。为筛选防治BLS的生防细菌,以Xoc的模式菌株RS105为靶标菌,采用平板稀释和抑菌圈法,从大白菜根际土壤中分离筛选到具有拮抗活性的细菌菌株512。通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA和gyrB序列分析,鉴定菌株512为蜡样芽孢杆菌,命名为Bacillus cereus 512。抑菌试验显示,B.cereus 512对黄单胞菌属不同种细菌的拮抗活性存在较大差异,其中对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)的拮抗效果最强。发酵液的稳定性试验表明,抑菌活性物质对高温和蛋白酶不敏感,耐强碱不耐强酸。在原丰早水稻品种上,针对水稻条斑病防治的初步试验结果显示,B.cereus 512对Xoc在水稻叶片上引起的水渍症状的扩展具有明显的抑制作用。综上所述,B.cereus 512能够拮抗Xoc和Xoo,在BLS的生物防治中将具有较大的应用潜力。     

水稻条斑病菌xopQ1_(Xoc)在病程中功能的初步研究

【目的】基因组学揭示,水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)中存在与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)中通过Ⅲ型分泌系统分泌的HopQ1-1同源的XopQ1Xoc,但其是否为T3S效应分子以及在病菌致病性中的功能并不清楚。【方法】通过基因敲除技术,获得了水稻条斑病菌xopQ1Xoc的突变体。【结果】致病性测定结果发现,xopQ1Xoc突变后,病菌在水稻上的毒性增强,细菌生长能力增强。非常有意义的是,xopQ1Xoc突变体菌液浓度为3×108CFU/mL时仍能在烟草上激发过敏反应,但在浓度为104CFU/mL时,8d后可在烟草上产生坏死症状。功能互补结果显示,xopQ1Xoc能够恢复突变体在水稻上的毒性至野生型水平和在烟草上丧失产生坏死病斑的能力。Western杂交结果显示,XopQ1Xoc不能通过T3S装置进行分泌。【结论】XopQ1Xoc是水稻条斑病菌T3S效应分子,可能作用于植物的免疫系统,有利于病害的发展。为进一步揭示水稻-黄单胞菌互作的分子机理提供了科学线索。     

牦牛角真皮乳头cDNA文库的构建

构建cDNA表达文库用于克隆和研究牦牛角生长相关基因.Trizol提取牦牛角真皮乳头总RNA并纯化mRNA,用ZAP Express cDNA Synthesis Kit合成双链DNA,进行末端修饰,接入ZAP表达载体.经Gigapack Ⅲ Gold Packaging extract体外包装,转染XL1-Blue MRF'宿主菌,形成初级文库,初级文库进一步扩增形成稳定的cDNA文库.结果表明,文库库容量为4×107,重组率达93%,为进一步从文库中筛选相关基因提供了有效工具.     

抗黑胫病烟草品种K326 cDNA文库的构建*

 以优质高抗黑胫病的烟草品种K326为材料,在苗期接种黑胫病菌丝,3d后取叶片用Trizol试剂提取总RNA,经电泳检测28S,18S条带清晰,无DNA污染。以总RNA为模板,采用SMART技术合成双链cDNA,其产物主要集中在0.5～3kb之间,最大片段超过3kb。合成的双链cDNA经SfiⅠ（A/B）酶酶切后,用CHROMA SPIN-400层析柱分离分级cDNA,将大于0.5kb的cDNA片段混合,载入λTriplEx2载体,构建成云南第一个烟草cDNA文库。该文库的大小为1.2×10⁷pfu。扩增文库的滴度达到1.2×10⁹pfu/mL。文库的重组率大于94%。取阳性克隆转化为质粒,通过PCR反应检测,重组体确有DNA插入, 其片断大小在0.5～1kb之间。     

牛睫毛毛囊生长期毛乳头细胞cDNA表达文库的构建

为构建高质量的牛睫毛毛囊生长期毛乳头细胞cDNA表达文库,以新生荷斯坦牛上眼睑为组织材料,显微解剖分离出高纯度的生长期牛睫毛乳头,Trizol一步法提取总RNA后纯化mRNA;用ZAP Ex-press cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA,进行末端修饰后接入ZAP表达载体。经GigapackⅢGold Pack-aging extract体外包装,转染XL1-Blue MRF′宿主菌,形成初级文库后进一步扩增,形成稳定的cDNA文库,文库库容量为3.3×107pfu/mL,重组率达95%。为进一步筛选、克隆生长期睫毛毛乳头特异性表达的基因、阐明睫毛毛囊发育的基因调控之分子机制奠定了研究基础。     

鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。     

长角血蜱卵cDNA表达文库的构建

 【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo（dT）引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106 PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109 PFU•ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素（DQ248886）的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。     

稻瘟病菌细菌人工染色体（BAC）基因组文库的构建

 稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用95-23-4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA,用限制性内切酶部分酶解后,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接,通过转化E.coli DH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了95-23-4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体（BAC）基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段29.1 kb,该文库覆盖7.4倍基因组,此基因组文库的构建为该菌致病相关基因的克隆奠定了基础。     

利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system）,以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）cDNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds cDNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到pPR3-N文库载体上,构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×10⁶ cfu,文库实际扩增数量大于1.3×10⁶ cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L^-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。     

水稻抽穗期基因酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350～2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。     

cDNA文库构建及其在植物抗性研究中的应用

cDNA文库是指生物不同生长发育时期特定组织或器官所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA与栽体连接后形成的克隆的集合,cDNA文库是在基因组水平上研究某一生物特定器官、组织和发育时期基因表达的前提和基础.笔者就近年来cDNA文库的构建及其在植物抗性研究中的应用作一综述.