受条斑病菌侵染的水稻cDNA文库构建

提取经条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)侵染诱导后的水稻mRNA,利用SMARTTM技术于载体pGADT7-SfiAB上构建了水稻cDNA文库.检测发现,文库中含有水稻病程相关蛋白基因OsPR-1a、OsPR-1b和PAL.随机提取cDNA文库克隆的质粒,酶切分析发现,该cDNA文库的插入片段分布在500～2 000 bp之间,平均大小约为1 kb,重组率达95%.上述结果表明,水稻受条斑病菌侵染的cDNA文库质量较好,这为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定了工作基础.     

软腐病菌诱导的大白菜抑制差减杂交文库构建及分析

利用抑制差减杂交技术构建了软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)侵染诱导的结球白菜叶片cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。随机挑取单克隆进行单向测序,获得1 107条长度大于100 bp、质量较好的ESTs序列。利用DNAstar5.0对上述ESTs进行聚类,共获取753个非冗余EST,包括有564个为单拷贝序列(Singletons)和189个重叠群(Contigs)。所获得的编码功能已知的EST有508个,将这些EST进行功能分类,可以看出所代表的基因参与植物体内的各种代谢反应,其中参与初级代谢和能量代谢的最多(33.3%),其次是参与抗病/防卫反应(12.6%)、再次为参与信号传导(11.4%)和蛋白质合成与加工(9.4%),参与细胞的结构与生长发育、物质运输、转录调控等过程的基因相对较少。RT-PCR分析结果表明,MAPK、SA、ROS等信号通路参与软腐病菌诱导的大白菜抗病防卫反应。     

西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB转录因子的克隆及表达分析

【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因CIMYB转录因子,进行生物信息学及表达模式分析,为进一步解析CIMYB在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和Microarray数据分析,获得与西瓜抗枯萎病相关的基因CIMYB,采用RT-PCR技术分离克隆CIMYB c DNA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征;使用MEGA5.0对CIMYB蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;采用GFP标记的方法进行亚细胞定位,分析编码蛋白表达位置;将该基因片段通过Nde I和Xba I双酶切连接至原核表达载体p Czn1,重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express,经终浓度为0.5 mmol·L~(-1) IPTG诱导4 h,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在西瓜与枯萎病菌互作中及在茉莉酸(jasmonate,JA)诱导下的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从西瓜野生材料PI296341-FR根系组织中克隆该基因片段(Gen Bank:KT751229),序列比对及生物信息学分析表明,其基因编码的氨基酸序列具有MYB转录因子R2R3型的典型特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,C端高度变异。多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与甜瓜MYB(Gen Bank:XM_008440304)和黄瓜MYB(Gen Bank:XM_011652633)同源性最高,其编码的氨基酸一致性达到86%,这与它们同属葫芦科植物有关;亚细胞定位显示CIMYB定位于细胞核,为典型的转录因子;成功构建了该基因的原核表达载体p Czn1-CIMYB,转化至大肠杆菌得到36 k D左右蛋白;CIMYB受枯萎病菌诱导,在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中,相对感病品种表达量高峰出现的早,且表达量高。50μmol·L~(-1)的Me JA处理可以显著提高感病材料Black diamond对枯萎病的抗病水平,同时诱导CIMYB表达,与抗病材料PI296341-FR相比表达趋势一致,但表达量更高。【结论】CIMYB为典型的R2R3-MYB转录因子,亚细胞定位于细胞核中;基因的原核表达得到36 k D的融合蛋白,在西瓜中的表达受枯萎病菌和茉莉酸诱导,推测CIMYB可能参与JA介导的西瓜抗枯萎病防卫反应的信号通路,在西瓜抗病中起一定的作用。     

溃疡病菌诱导下毛白杨防御相关基因的应答反应

[目的]研究溃疡病菌诱导下毛白杨防御相关基因的应答反应.[方法]以毛白杨为试验材料,用溃疡病菌对7月龄幼苗进行接种,提取诱导前后的毛白杨树皮mRNA,通过反转录生成cDNA,构建72 h差异表达的SSH-cDNA文库.随机挑选199个阳性克隆进行测序,将测序结果与NCBI基因库中序列进行比较,并对这些EST在dbEST数据库进行同源检索分析,利用RT-qPCR对文库中7个基因进行进一步分析.[结果] 172个EST找到了同源序列,其中有32个序列与防御相关.在毛白杨受到溃疡病菌诱导时,这些防御基因的表达量明显上升.[结论]该研究为开展毛白杨抗溃疡病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础.     

水稻细菌性条斑病的广谱抗性资源筛选

[目的]筛选在多个生育期对多个强致病力细菌性条斑病病菌具有广谱抗性的水稻材料,为水稻细菌性条斑病抗性品种的培育提供可靠抗源材料.[方法]以1100份具有丰富遗传背景的水稻品系为试验材料,以高感病品种金刚30为感病对照,以5株强致病力水稻细菌性条斑病病菌为接种对象,采用针刺法进行多生育期、多个强致病力细菌性条斑病菌菌株重复接种抗性筛选鉴定.[结果]初筛获得14份抗病材料,占全部材料的1.27%.复筛获得9份具有中抗级别以上的材料,占全部材料的0.82%,其中有3份材料(RL6、RL9和RL14)在水稻的3个生育期对多株水稻细条病菌菌株具有抗性,尤其是RL6表现出对多菌株的广谱抗性,且抗性水平高;6份材料(RL2、RL4、RL5、RL8、RL11和RL12)在单个生育期对单株水稻细条病菌菌株具有抗性.[结论]获得3份对水稻细菌性条斑病具有多生育期广谱抗性的材料,可作为重要的抗源应用于水稻抗性品种培育,其中RL6可作为优质抗源优先应用于水稻抗性品种培育;获得6份在特定生育期对水稻细菌性条斑病具有抗性的材料,可作为候选抗源应用于水稻抗性品种培育.     

黄瓜CsGPX基因克隆与细菌性角斑病胁迫下的表达分析

[目的]克隆CsGPX基因并研究其与黄瓜抗病性的关系.[方法]采用RT-PCR技术克隆黄瓜CsGPX基因cDNA序列全长,并对其进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR的方法分析CsGPX基因在细菌性角斑病侵染0～96 h下的表达情况.[结果]CsGPX基因cDNA序列全长914 bp,包含一个513 bp的开放阅读框,编码170个氨基酸,该基因编码蛋白的相对分子质量约为19.02 kD,理论等电点是8.66,为亲水性蛋白,不具有跨膜结构,不含信号肽序列.实时荧光定量PCR分析表明,CsGPX在黄瓜叶中有表达.在黄瓜细菌性角斑病菌侵染下,该基因在黄瓜叶中表达增高,明显受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导.[结论]CsGPX基因的分子鉴定为进一步解析该基因在黄瓜抗病机制方面的作用提供重要依据.     

西瓜与枯萎病菌非亲和互作的表达序列标签分析

目的从整体水平上阐明西瓜与枯萎病菌非亲和互作基因表达的特征。方法用SSH方法构建枯萎病菌接种处理后不同时间点的cDNA文库,对其中获得3895条高质量的表达序列标签(EST)序列进行分析。结果在测定4431条cDNA序列中,序列拼接后获得1756条unigene,经过注释和分析,发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因,及茉莉酸和木质素生物合成途径等。结论在西瓜与枯萎病菌互作的SSH-cDNA文库中,与抗病防御相关基因约占36.3%,初步了解了西瓜与枯萎病菌非亲和互作过程中基因表达信息,这些基因的发现为在分子水平上研究西瓜与枯萎病菌的互作机制以及相关重要基因的克隆与功能分析奠定基础。     

白粉菌诱导的中国野生毛葡萄抑制消减文库构建及EST序列分析

【目的】构建白粉菌诱导下中国野生毛葡萄"商-24"的抑制消减文库,获得抗白粉病差异表达基因EST序列。【方法】应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建白粉菌诱导下高抗白粉病的中国野生毛葡萄"商-24"叶片SSH-cDNA文库,通过生物信息学方法对文库中的EST序列进行分析。【结果】成功构建了白粉菌诱导的中国野生毛葡萄"商-24"抑制消减cDNA文库,对消减文库测序后获得了200个EST序列,大小为300～1000bp;BLAST分析表明,其中19个EST序列与已知功能基因序列同源性很高,分别参与了植物的防卫反应、胁迫反应、细胞解毒和信号转导等。【结论】获得了葡萄抗白粉病的EST序列,这为进一步克隆抗葡萄白粉病基因、探明其抗病分子机理奠定了基础。     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析（摘要）

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

感染与未感染桃拉病毒凡纳宾对虾基因差异表达文库的构建

为了寻找对虾抗桃拉病毒(TSV)相关基因信息,研究对虾抗TSV分子机理。应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建TSV感染后存活凡纳宾对虾与未感染凡纳宾对虾的基因差异表达文库,并通过相对定量PCR以及斑点杂交分别对SSH的效率以及文库的可靠性进行验证。结果表明,SPR凡纳宾对虾和SPF凡纳宾对虾攻毒后的死亡率分别为12%和90%;在SSH系统中,相对于未进行杂交的cDNA样品,杂交后的cDNA样品的β-肌动蛋白(β-actin)几乎没有被检测出,说明SSH操作系统是高效率的。通过文库构建则获得正负2个文库,其中正库含阳性克隆1051个,负库含阳性克隆580个;而经斑点杂交验证,共获差异表达克隆321个,其中攻毒组高表达克隆270个,未攻毒组高表达克隆51个。可见,SPR凡纳宾对虾具有较强的抗TSV能力,以之为基础构建的对虾基因差异表达文库具有高度的可靠性,由文库得到的基因信息对获取对虾抗(TSV)相关基因具有潜在的应用价值。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

根癌农杆菌胁迫下多花蔷薇（Rosa multiflora'Inermis 4'）的基因表达分析

  多花蔷薇无刺4号（Rosa multiflora'Inermis 4'）对根癌病有较强抗性。以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接种多花蔷薇无刺4号为目的材料,刺伤处理为对照,采用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）方法,构建了富集多花蔷薇根癌病抗性相关基因的差减cDNA文库。差异筛选差减cDNA文库后,随机选取增强表达的92个克隆进行测序,去除冗余的cDNA和病菌的基因片段,共得到53个单一序列。利用GenBank数据库进行核酸和蛋白质同源性比较,获得的cDNA片段功能涉及：细胞分裂、生长（22个克隆）,逆境防御、信号转导及激素调节（11个克隆）以及初生与次生代谢（10个克隆）。另有10个基因片段功能未知,可能为新的EST。根据测序及比对分析结果,对多花蔷薇无刺4号抗根癌病的分子机理进行了探讨。     

广西水稻白叶枯病有效抗病基因和抗性亲本的筛选

[目的]明确可在广西利用的白叶枯病抗病基因和抗病亲本。[方法]利用白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae）广西优势菌型IV菌接种一套水稻抗白叶枯病单基因系、广西主要的杂交稻亲本和一些重要的种质材料,并调查了其抗感情况。[结果]对IV型菌具抗性的品种有IRBB5、IRBB7和CBB23,且分别含有抗病基因xa5、Xa7和Xa23,确认为白叶枯病菌IV型菌的有效抗病基因。[结论]为抗白叶枯病育种提供了依据。     

棉花蕾铃离层脱落相关基因的克隆及其表达分析

[目的]研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,为解析离层脱落相关基因的表达、调控及功能鉴定提供基础资料.[方法]以50 mg/L赤霉素(GA3)和250 mg/L乙烯利(CEPA)分别处理的棉花蕾铃离层cDNA为Tester,H2O处理的棉花蕾铃离层cDNA为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建经GA3和乙烯处理后的消减文库,反向Northern blo-tting筛选出离层差异表达的EST序列,然后进行基因功能注释与功能分类,并分析蕾铃离层差异表达基因的组织表达模式和GA3诱导表达规律.[结果]以GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为GA文库;以CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为CE文库.从构建的两个消减文库(GA和CE)中共筛选出29个在离层差异表达的EST序列,通过基因功能注释与功能分类,可将这些EST序列分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能等九大类,其中与翻译相关的EST序列占24.14%,说明经激素处理后棉花蕾铃离层有大量的蛋白合成.从消减文库中挑选10个差异表达基因(EST序列)进行RT-PCR分析,结果发现以GA3处理棉花蕾铃离层后部分相关基因的表达模式会发生变化.[结论]棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达,进而影响器官脱落,是其对逆境胁迫反应的结果.     

毛竹萌发种子全长cDNA文库的构建

[目的]构建毛竹萌发种子的全长cDNA文库。[方法]以毛竹萌发种子为材料,利用Oligo-capping法构建其全长cDNA文库。[结果]试验得到文库的库容达650万克隆,空载较少;插入片段大小在0.3～5.0 kb之间,片段大小的分级严格且一致性良好,其中显著的是长片段全长cDNA(1.0～5.0 kb)的比例高达30%,达到了高质量全长cDNA文库的标准。[结论]毛竹萌发种子全长cDNA文库的成功构建将为竹类植物功能基因组研究奠定重要的前期科研基础。     

梅花鹿心脏组织cDNA文库的构建

[目的]构建梅花鹿心脏cDNA文库。[方法]提取梅花鹿心脏总RNA,纯化mRNA;合成双链cDNA,连接载体,并电转化至感受态细胞;测定文库的克隆数、重组率及插入片段大小。[结果]经鉴定,所构建梅花鹿心脏组织cDNA文库,库容量为3.8×106个克隆,重组率为100%,插入片段大小为0.5～2.0kb,平均长度约为1.0kb。[结论]所构建cDNA文库的各项指标均达到要求。     

油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因的初步分析

采用抑制性消减杂交技术,以甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1" 及野生型"3529"为材料构建与植株高矮性状关系最为密切的茎尖差异表达抑制消减cDNA文库.所建cDNA文库插入片段大小主要集中在100～500 bp之间.斑点杂交筛选得到30个阳性克隆,序列测定和同源性对比分析表明,所得克隆功能涉及到第二信使、转录因子、激素代谢、蛋白质降解及转运等多个方面.并对其中几个差异表达基因的功能进行了初步分析,为进一步认识油菜植株矮化机理奠定了基础.     

烤烟品种K326茎叶消减文库的构建及质量分析

利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建烤烟品种K326的茎叶抑制性消减cDNA文库.结果表明,文库的滴度为1.76×106cfu.mL-1,重组率为75%,随机扩增480个克隆,显示插入片段长度在200-1000 bp之间,符合建库的质量标准.