利用双向电泳技术分离野牛草叶片蛋白的方法研究

制备野牛草叶片蛋白质样品,对双向电泳条件等技术环节进行优化,以期获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱,建立适应野牛草叶片蛋白组学研究的技术平台,并对其蛋白组进行初步分析。采用TCA/acetone沉淀法和Trizol沉淀法分别提取野牛草叶片蛋白,通过不同聚焦时间分离,最终经硝酸银染色,以Imagemaster 2D Platinum V 5.0图像分析软件对所得的双向电泳图谱进行分析比较。对获得的最佳图谱进行蛋白点分布分析,选择最适合的胶条pH值。结果表明:Trizol沉淀法提取蛋白样品,总聚焦伏时数在8~10万V.h间,为最适合条件,获得图谱背景清晰,纵横纹少,蛋白点分离较完全,在pH3~10胶条凝胶可检测到的蛋白质点达到800个。对蛋白点pH分布范围分析表明,85%蛋白点分布在pH4~7之间,选择pH4~7的IPG胶条,能检测到1 000个以上的蛋白点。以Trizol沉淀法结合优化的双向电泳参数对野牛草叶蛋白组进行双向电泳分离,获得了高分辨率、高重复性的双向凝胶电泳图谱,可用于野牛草差异蛋白质组学研究。     

红豆杉细胞蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

[目的]探索适用于红豆杉愈伤蛋白质组学研究的样品制备方法。[方法]以红豆杉愈伤组织为材料,分别采角三氯乙酸（TCA）／丙酮沉淀法、Tris—HCl法和酚-甲醇／醋酸铵沉淀法提取其中的总蛋白,通过双向电泳（2DE）检测3种方法对总蛋白的提取效果。[结果]3种方法提取的蛋白样品2DE图谱显示的蛋白点数量均较多。TCA／丙酮沉淀法对蛋白质的提取率较高,2DE图像清晰,条纹少,拖带现象轻;Tris—HCl法提取的蛋白样品2DE图谱个别区域出现较轻的云片状聚集,并有轻微拖带现象;酚-甲醇／醋酸铵沉淀法提取蛋白样品的2DE图谱有条纹和拖带现象。[结论]TCA／丙酮沉淀法提取的蛋白质质量较高,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量大。     

菜籽蛋白质组双向电泳技术体系的优化研究

[目的]建立适用于菜籽蛋白质组研究的双向电泳技术。[方法]以湘油17号为材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、凝胶浓度、上样量等条件进行了优化。[结果]使用TCA一丙酮法提取菜籽总蛋白最佳,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数最多。当采用pH3～10IPG胶条和12％的凝胶、上样量为250μg时,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。[结论]为开展油菜种子蛋白质组学研究奠定了基础。     

潮间带大型海藻小珊瑚藻蛋白质提取方法及双向电泳体系优化

为建立适用于潮间带大型海藻小珊瑚藻(Corallina pilulifera)蛋白质组学分析的样品制备方法,分别用饱和酚抽提法、三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法、Trizol提取蛋白法、Biozol提取蛋白法、饱和硫酸铵沉淀法对蛋白质进行提取,筛选出小珊瑚藻蛋白质提取的最优方法,并从胶条pH值和分离胶浓度探究双向电泳系统的优化条件。结果表明,在胶条pH值为4～7和分离胶浓度为12.5%条件下,并使用饱和酚抽提法提取蛋白质,所提取蛋白质不仅浓度高且纯度较高,因而可获得稳定清晰、蛋白质点数较多的双向电泳图谱。该体系可为红藻门大型海藻的蛋白质组学分析提供重要的技术参考。     

烟草根系蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

为探索适于烟草根系蛋白质组学研究的样品制备方法,以栽培品种K326生长期根系为材料,比较了常规裂解液法、TCA/丙酮沉淀法、Trizol抽提法和酚法等4种总蛋白质的提取方法。对制备的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)检测。结果表明:酚法最佳,所获蛋白在单向SDS-PAGE中形成条带数目多而清晰;经双向电泳分离用银染显色,可检测约548个蛋白点,图谱分辨率较好,蛋白点清晰,主要集中在等电点pH5～8、相对分子量25.0～70.0kD,可有效解析烟草根系的蛋白质组。     

葛枣猕猴桃叶片蛋白质双向电泳体系的研究

[目的]建立葛枣猕猴桃叶片蛋白质双向电泳体系。[方法]通过对不同的蛋白质提取方法、裂解液配方及IPG胶条的探索,建立适应于葛枣猕猴桃叶片双向电泳技术体系。[结果]TCA/丙酮法+配制裂解液较适用于葛枣猕猴桃叶片蛋白质组分析。最终可获得蛋白质点丰富、分辨率高的双向电泳图谱,可以检测出450个清晰的蛋白质点。[结论]该研究为在蛋白质组水平揭示叶片颜色变化的调控机制奠定基础。     

独行菜属植物种子总蛋白4种提取方法的比较

【目的】研究适用于抱茎独行菜和独行菜种子SDS-PAGE电泳和双向电泳的蛋白样品提取方法,为研究两种独行菜种子蛋白组学奠定基础。【方法】采用4种蛋白质提取方法提取种子总蛋白,测定和分析蛋白产量和SDS-PAGE电泳图谱。【结果】TCA/丙酮提取法获得蛋白量较多,杂质少,电泳条带多且清晰;裂解液提取法蛋白的产量最高,有拖尾且杂质多;Tris-HCl提取法和苯酚提取法的蛋白产量低,杂质少;裂解液提取法和苯酚提取法获得的蛋白在SDS-PAGE电泳时易产生高丰度蛋白的干扰。对比TCA/丙酮提取法和苯酚提取法获得的两种独行菜种子总蛋白SDS-PAGE图谱,发现有6条蛋白差异条带。【结论】TCA/丙酮提取法提取两种独行菜种子总蛋白效率高,纯度高且杂质少,可用于SDS-PAGE电泳和双向电泳分析;两种独行菜种子蛋白SDS-PAGE电泳的差异谱带可为甄别两种独行菜种子提供参考依据。     

石斛叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立及优化

以石斛叶片为材料,建立了一套适用于石斛蛋白质组分析的双向电泳体系,探讨了石斛叶片蛋白的提取、蛋白定量以及双向电泳的一些关键技术。结果表明,通过三氯乙酸(TCA)法提取、高压等电聚焦和两步平衡等方法可以获得稳定、清晰的双向电泳图谱,获得了可分辨蛋白质斑点数约613个。     

苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

 为探索适用于苹果叶片蛋白质组学研究的样品制备方法,比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法（TCA）、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法和Tris-HCl提取法等3种总蛋白质的提取方法。制备的样品经双向电泳分离采用银染显色。结果3种方法分别得到450、374和1032个蛋白质点。认为Tris-HCl提取法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大。     

适于双向电泳分析的水稻纹枯病菌菌体蛋白提取方法的比较

为建立水稻纹枯病菌菌体蛋白的双向电泳技术,获得分辨度高、重复性好的双向电泳图谱.采用了酚抽提法、TCA/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法进行水稻纹枯病菌菌体蛋白质的提取,利用17cm、pH 5 ～8的IPG胶条对样品进行双向电泳,用PDQuest 8.0软件对电泳图谱进行分析,确定电泳的最佳参数.结果显示:采用17cm、pH 5 ～8的IPG胶条能得到较好的双向电泳图谱;同一样品的三种不同蛋白提取方法(酚抽提法、TCA/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法)分别得到1278、885、827个蛋白质点.酚抽提法能有效去除样品中的盐分和小分子的干扰,得到背景清晰的蛋白图谱;TCA/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法所得图谱有一定的杂质干扰,同时TCA/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法有蛋白点缺失,尤其在碱性端存在明显缺失现泉.研究结果建立了一套适于水稻纹枯病菌菌体蛋白的可靠提取方法和双向电泳体系,为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础.     

UV-C辐射对拟南芥基因组完整性及蛋白表达的影响

[目的]探究UV-C辐射对基因组完整性及蛋白表达的影响。[方法]CTAB法提取拟南芥基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。用TCA/丙酮法提取叶片总蛋白,通过SDS-PAGE凝胶检测蛋白表达变化。[结果]拟南芥基因组DNA随UV-C辐射时间的延长断裂明显增强、并诱导产生1条分子量约为66 kDa的蛋白条带。[结论]UV-C辐射可以引起拟南芥基因组DNA的断裂,对蛋白也有一定程度的影响。     

用于SSR分析的大豆干种子DNA提取条件的优化

[目的]探讨适于SSR分析的大豆干种子DNA提取的最佳方法。[方法]以2个大豆品种的干种子为材料,分别采用改良SDS法和CTAB法提取大豆基因组DNA,用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,用紫外分光光度计分别测定其DNA在A230、A260和A280下的吸光值,根据A260／A230和A260／A280的比值检测DNA的纯度和浓度,并分别以两种DNA为模版进行SSR—PCR扩增。[结果]相同DNA提取条件下,SDS法提取DNA样品的纯度和浓度均高于CTAB法,SDS终浓度为2％（W／V）,水浴15min,氯仿／异戊醇抽提2次时所提取大豆种子DNA的纯度及浓度最高,其DNA的0D260／0D280值为1．86,SDS法所提的DNA泳带分布较集中,无拖尾现象,其DNA浓度能够满足SSR扩增模板的需求。[结论]SDS浓度为2％（W／V）,水浴15min,氯仿／异戊醇抽提2次时提取大豆干种子DNA的浓度和纯度都较高,可以满足后续的各种分子生物学操作的要求。     

枣树叶片蛋白质提取及SDS-PAGE单向电泳条件优化

[目的]对枣树叶片蛋白质提取方法及其SDS-PAGE单向电泳条件进行优化。[方法]对枣树5种蛋白质提取方法和影响SDS-PAGE单向电泳的因素进行比较研究。[结果]改良丙酮沉降法提取出的蛋白质杂质较少,条带数量多且清晰,同时通过研究确定了一套适用于枣树蛋白检测的SDS-PAGE凝胶制备及电泳方法。[结论]该研究为进一步从分子生物学的角度研究枣树与枣疯病植原体的互作机制提供了技术的基础。     

东北羊角芹籽挥发性成分的GC/MS分析

[目的]对东北羊角芹籽挥发油化学成分进行研究。[方法]采用超临界CO2流体萃取东北羊角芹籽中的挥发油,然后用GC-MS进行成分分析,用峰面积归一化法定量,并与水蒸汽蒸馏法获得的精油成分进行比较。[结果]用从超临界萃取法萃取挥发油中,共鉴定出18种成分,主要成分为芹菜脑（59．5％）、十一烷（18．99％）和柠檬烯（5．23％）。水蒸汽蒸馏法提取芹莱籽,共鉴定出14种成分,主要成分为芹菜脑（21．63％）、十一烷（41．14％）和柠檬烯（13．04％）阻水芹烯（6．82％）。虽然2种方法得到的东北羊角芹籽主要成分的组成不相同,但两者所含芹菜脑都较多,表明东北羊角芹籽挥发油的代表化合物为芹菜脑。[结论]该研究为东北羊角芹籽活性成分的研究提供了理论依据。     

兴安落叶松DNA提取-试剂盒改良法

[目的]寻找一种快速简便的兴安落叶松基因组DNA的提取方法。[方法]对DNA提取试剂盒进行改良,与原试剂盒法(离心柱)进行比较,并用琼脂糖凝胶电泳、蛋白核酸测定和ISSR-PCR对所提取的总DNA进行检测。[结果]试剂盒改良法提取的总DNA纯度和浓度较高,电泳显示其主条带较清晰,无降解现象,A260/A280值为1.75～1.84。[结论]改良后的DNA提取方法更适合兴安落叶松基因组DNA的提取。     

鸡血藤DNA提取方法的研究

[目的]筛选一种适合鸡血藤DNA的提取方法。[方法]以鸡血藤嫩叶为材料,分别采用液氮-CTAB法、石英砂-CTAB法以及石英砂-SDS法提取基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的DNA样品,对提取方法进行比较筛选。[结果]电泳检测中,石英砂-CTAB法所提DNA条带亮度最高,质量较好。紫外检测中,石英砂-CTAB法提取的DNA A260/A280值大于1.8,比其他两种方法提取的DNA蛋白质污染小,其提取的DNA纯度和得率均最高,液氮-CTAB法提取DNA得率居中,石英砂-SDS法提取DNA得率较低。[结论]该研究结果表明石英砂比液氮更能简便快速地将叶片研碎,CTAB提取缓冲液比SDS提取缓冲液可更有效地去除杂质,使细胞裂解、DNA析出。因此,石英砂-CTAB法更适合鸡血藤DNA的提取。     

桑黄多糖脱蛋白方法与条件的优化

[目的]对桑黄多糖提取液中的蛋白质去除方法和条件进行了优化,并比较了2种方法对蛋白质去除的影响。[方法]采用Sevag法与三氯乙酸（TCA）法去除桑黄多糖中的游离蛋白质。[结果]三氯乙酸法去除蛋白质的效果优于Sevag法,其最佳脱蛋白条件为：5%三氯乙酸用量,处理3次,反应时间30min,。在此条件下,蛋白质去除率为82%,多糖损失率为10.8%。[结论]TCA法为最佳的桑黄多糖脱蛋白方法。     

白芷种子蛋白质提取方法的比较

[目的]建立适用于白芷种子的SDS-PAGE蛋白质样品提取方法。[方法]比较5种提取方法所获得白芷种子总蛋白质产量以及SDS-PAGE电泳的谱带数目、强度和电泳分辨率等方面的差异。[结果]方法 a所提蛋白质含量高,杂质少,电泳谱带清晰;方法 b所提蛋白质溶液电泳谱带清晰,分辨率较高,但提取含量较低;方法 c和d所提蛋白质杂质较多,纯度不高,分辨率较低;方法 e所提蛋白质纯度较高,但蛋白条带缺失较多。[结论]方法 a提取白芷种子蛋白质的效果最好,所提蛋白效率较高,杂质少,电泳谱带清晰,分辨率高,谱带数多,优于其他提取法。     

小麦不同部位DNA提取的比较研究

[目的]探讨小麦不同取材部位对DNA提取质量和产率的影响。[方法]分别以小麦的种子、根尖和幼嫩叶片为材料,采用改良CTAB法分别提取小麦3个部位的基因组DNA,用0．8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,用紫外分光光度计分别测定3个部位的DNA在A260和A280下的吸光值,根据A260/A280的值检测DNA的浓度和纯度,并以3个部位提取的DNA为模版进行RAPD扩增。[结果]采用小麦叶片提取DNA的产率最高,种子次之,根尖最低。3个部位提取的DNA纯度均相近,提取叶片获得的DNA浓度最大,为756μg/ml;其次是种子,为233μg/ml;根尖获得的DNA浓度最低,为90μg/ml。小麦不同部位提取的DNA模板对RAPD扩增没有明显影响,DNA浓度都能达到扩增的要求。[结论]小麦3个部位提取的DNA质量均较好,可以进行后续的酶切和PCR扩增等实验。