家蚕miR-14的上调表达与靶基因的预测分析

【目的】了解家蚕细胞中上调miRNA的方法及靶基因预测,为家蚕miRNA的功能研究提供方法参考。【方法】构建家蚕miR-14的真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14并在家蚕BmN细胞中表达,同时通过转染化学合成的miRNA mimics上调BmN细胞中miR-14的水平。首先通过PCR扩增miR-14的前体及其侧翼序列（pri-mir-14）并克隆至真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP的EGFP基因下游。分别将重组质粒pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14、对照质粒pSK-hr3-ie1-EGFP、bmo-miR-14 mimics和negative control mimcs转染至家蚕BmN细胞,观察EGFP及FAM在细胞中的荧光情况,以检测其转染效率,qRT-PCR方法检测bmo-miR-14在细胞中的水平。分别采用RNAhybrid和miRanda预测bmo-miR-14的靶基因。【结果】重组表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14与miRNA模拟物bmo-miR-14 mimics都能上调BmN细胞中的miR-14水平,与对照相比分别提高了2.1、984倍。利用生物信息学方法预测bmo-miR-14靶基因,RNAhybrid和miRanda分别预测得到153和171个潜在bmo-miR-14靶基因,其中两者共同预测的靶基因有49个。GO分析结果显示,预测的49个靶基因的分子功能集中于结合和催化;而生物学过程集中于细胞过程和代谢过程。【结论】通过转染重组质粒及化学合成miRNA mimics,使细胞中相应的miRNA上调,可用于bmo-miR-14后续的功能研究。     

家蚕GATA转录因子BmGATA6的克隆、多克隆抗体制备及组织细胞定位

【目的】克隆家蚕（Bombyx mori）GATA转录因子BmGATA6,将其在原核细胞中进行表达,纯化重组蛋白,多次免疫小鼠获得BmGATA6多克隆抗体,为进一步分析BmGATA6在家蚕变态发育中的功能提供抗体条件。【方法】解剖家蚕获得5龄第3天的各组织及4眠至熟蚕整个时期的中肠组织,在液氮中研磨为粉末,利用Trizol法提取RNA,体外反转录得到cDNA。基于家蚕BmGATA6的基因编码序列设计全长特异引物,并以BmActin3作为内参,进行家蚕5龄第3天各组织及4龄眠期至熟蚕期各时期的RT-PCR检测。设计原核表达引物,扩增原核表达片段连接到pET32a载体上,构建原核表达载体,转化至BL21(DE3) Escherichia coil表达菌株。加入IPTG至终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L^-1。在16℃条件下培养20 h和37℃条件下培养5 h分别进行BmGATA6蛋白诱导表达。选取最佳诱导条件进行BmGATA6蛋白的大量诱导,用镍柱亲和层析法纯化家蚕BmGATA6蛋白,经多次免疫昆明小鼠后,最终获得BmGATA6多克隆抗体。利用ELISA法测定鼠抗BmGATA6蛋白多克隆抗体的效价,通过Western blot检测BmGATA6抗体的特异性。以家蚕5龄第6天中肠的石蜡切片作为样本,通过免疫荧光对家蚕中肠组织中的BmGATA6蛋白进行亚细胞定位。【结果】家蚕GATA转录因子BmGATA6的cDNA全长4 011 bp,ORF长为1 974 bp,编码657个氨基酸,包括205 bp的5′非翻译区序列（5′UTR）和1 832 bp的3′非翻译区序列（3′UTR）。该基因位于15号染色体上,基因全长12 326 bp,为多外显子基因,共含有8个外显子和7个内含子,具有2个典型的GATA锌指结构域,分别位于第470-521和531-582氨基酸区域。RT-PCR结果显示BmGATA6在5龄第3天家蚕中肠中显著高量表达,其次在马氏管中有少量表达,而在其他组织中没有检测到BmGATA6的表达。同时RT-PCR结果显示BmGATA6在4龄眠期到熟蚕期的中肠组织中持续高表达。构建BmGATA6 原核表达载体,通过不同温度与IPTG浓度诱导发现,BmGATA6重组蛋白在16℃诱导主要存在于上清中,在37℃诱导主要存在于包涵体中。在0.6 mmol·L^-1的IPTG、16℃下诱导20 h为最佳条件,利用镍柱亲和层析法获得较纯的BmGATA6重组蛋白,并利用纯蛋白多次免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用ELISA法对抗体效价进行了检测,显示BmGATA6抗体效价均高达1﹕128 000。Western blot结果显示BmGATA6抗体能特异地识别家蚕BmGATA6蛋白,其大小约为75 kD,与预测大小相符。免疫荧光结果显示BmGATA6蛋白在家蚕中肠的各类细胞中均有较高表达,且定位于中肠细胞的细胞核中。【结论】成功制备了BmGATA6多克隆抗体,分析了其在中肠组织中的亚细胞定位情况,推测BmGATA6在家蚕中肠的生理变化过程中扮演着重要调控角色,为进一步探索BmGATA6在家蚕中的功能奠定了基础。     

miR-663通过靶向TGF-β1调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成

【目的】预测和验证羊驼TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,并对mi R-663介导的TGF-β1在黑色素生成过程中的作用进行研究。【方法】利用Targetscan、RNAhybrid和RNA22在线预测mi R-663的靶基因,并对靶基因3′UTR区可能的mi R-663的作用位点进行分析。利用DNAMAN软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物TGF-β1-3′UTR区的相似性。利用SacⅠ和XbaⅠ将羊驼TGF-β1基因的3′UTR区插入pmir GLO构建双荧光报告载体pmir GLO-TGF-β1-3′UTR并与mi R-663 mimic共转染293T细胞,通过测定荧光素酶活性来验证mi R-663的直接靶基因是TGF-β1。在羊驼黑色素细胞中通过转染mi R-663 mimic来过表达mi R-663,并利用q RT-PCR和Western blotting检测mi R-663过表达后细胞中TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7和β-catenin分别在m RNA和蛋白水平的变化及黑色素含量的变化。【结果】软件预测显示mi R-663有68个保守的靶基因,包含74个保守的靶位点和44个非保守靶位点。TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,且已被证明与毛囊发育和黑色素生成相关。不同物种的TGF-β1基因的3′UTR区相似性较高且均存在多个保守的mi R-663靶位点。克隆了羊驼TGF-β1基因3′UTR区发现存在3个保守的mi R-663靶位点。成功构建包含3个mi R-663作用位点的pmir GLO-TGF-β1-3′UTR双荧光报告载体并与mi R-663 mimic共转染293T细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示:与对照组相比,试验组pmir GLO-TGF-β1-3′UTR+mi R-663 mimic荧光素酶活性下调31.01%,表明TGF-β1是mi R-663直接的靶基因。在羊驼黑色素细胞中转染mi R-663 mimic后:mi R-663表达量上调334倍,TGF-β1、β-catenin、Smad4基因的表达量分别下调89%、41%、34%;TGF-β1蛋白表达量下降了21%,β-catenin蛋白表达量无明显差异;黑色素细胞中的黑色素含量下降42%。【结论】TGF-β1是mi R-663的直接靶基因。mi R-663通过调控TGF-β1的表达而影响TGF-β/Smad和Wnt信号通路,进而影响羊驼黑色素细胞中的黑色素生成。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒系统超量表达家蚕let-7簇microRNAs

【目的】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统超量表达家蚕（Bombyx mori）let-7 簇（cluster）microRNAs：bmo-let-7、bmo-miR-100和bmo-miR-2795,为研究家蚕microRNA的功能提供参考。【方法】克隆家蚕let-7 miRNA簇（bmo-let-7 cluster,bmo-let-7-C）上各miRNA前体(pri-let-7、pri-miR-100与pri-miR-2795)和bmo-let-7-C全长序列,以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因为报告基因,昆虫细胞表达载体pFastBac1为穿梭载体,通过Tn7转座子把目的基因和报告基因转座到杆状病毒A. californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV)基因组上,获得各重组杆状病毒质粒（recombinant baculovirus plasmid,rBacmid）：Bac-let-7、Bac-miR-100、Bac-miR-2795和Bac-let-7-C。将重组Bacmid转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9,72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测miRNAs的表达。对转染的Sf9细胞进行、离心、收集上清液,获得具感染力的重组病毒,用于侵染新培养的Sf9细胞和注射家蚕幼虫个体,72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测miRNAs的表达。【结果】成功将bmo-let-7-C上各miRNA前体和bmo-let-7-C全长序列构建到杆状病毒基因组上,获得了各miRNA及bmo-let-7-C的过量表达载体。将各重组过量表达载体分别转染草地贪夜蛾细胞系Sf9,72 h后在显微镜下观察到了红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测结果表明各miRNA显著过量表达;通过离心收集的各miRNA重组过量表达病毒粒子感染新培养的Sf9细胞72 h后检测到了更强的红色荧光蛋白信号,定量PCR结果表明各miRNA均显著过量表达。将各miRNA的重组病毒注射到家蚕5龄1 d幼虫体内后,均能显著超量表达相应miRNA,但注射Bac-let-7-C后只有miR-2795显著过量表达,并有明显的组织差异性,在丝腺中没有过量表达,在脂肪体、血液和中肠中显著过量表达。【结论】利用杆状病毒过量表达系统在草地贪夜蛾细胞系Sf9和家蚕个体中超量表达了家蚕let-7簇miRNAs,为研究家蚕let-7簇和其他miRNAs的产生机制和功能提供了参考。     

MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成

【目的】深入解析番茄miR828的生物学功能,特别是参与番茄缺磷胁迫响应和花青素生物合成的调控作用。【方法】分别利用psRNATarget和RLM-5′ RACE预测和验证miR828在番茄中的靶基因。用MegAlign和MEGA5对番茄SlMYB7-like与部分R2R3 MYB转录因子氨基酸序列进行了多重比对和进化树分析。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMyb7-like在AC、MicroTom和LA1996 3个不同番茄种质中的表达和miR828在番茄（AC）中的组织特异性表达模式。以miR828过表达转基因番茄和野生番茄为材料,设置正常供磷（+Pi,MS+KH₂PO₄ 3.4 g·L^-1）和缺磷（-Pi,MS+KCl 1.86 g·L^-1）2个处理的培养试验。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因在缺磷胁迫下的表达模式。将野生型和miR828过表达的转基因番茄植株缺磷培养15 d后,观察番茄植株地上部分和地下部分的表型差异,通过qRT-PCR分析miR828、miR828的靶基因SlMyb7-like（SGN-U320618）和花青素合成相关酶基因（PAL、CHS、DFR、ANS、3GT和F3′H）的表达模式,应用分光光度计测量各样品的花青素含量。【结果】RLM-5′ RACE剪切试验表明miR828对靶基因SlMyb7-like存在剪切调控作用,且剪切作用位点位于成熟miR828的第10位和第11位核苷酸之间,从而验证了SlMyb7-like是 miR828直接作用的靶基因。氨基酸序列多重比对及进化树分析显示番茄SlMYB7-like与拟南芥AtMYB7和金鱼草MYB330的序列相似性最高。SlMYB7-like含有与花青素合成相关的保守氨基酸基序。miR828在MicroTom幼苗中的表达最高,在LA1996中的表达最低。相反,miR828靶基因SlMyb7-like在LA1996中的表达水平最高,在MicroTom中的表达水平最低。qRT-PCR分析显示SlMyb7-like的表达模式与miR828相反,证明SlMyb7-like被miR828调控。正常供磷条件下,野生型番茄各组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高;miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量降低为野生型植株的30%-60%,花青素含量降低为野生型植株的40%。在缺磷胁迫下,野生型和miR828过表达转基因番茄植株中miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达均受到诱导上调表达;转基因番茄植株地上部分和根系生长受到的抑制程度均小于野生型番茄;转基因番茄植株的颜色较野生型番茄植株颜色浅;转基因番茄植株中SlMyb7-like、花青素合成相关基因的表达以及花青素含量均低于野生型植株;miR828过表达转基因番茄植株缺磷胁迫耐受性却高于野生型番茄。【结论】在番茄中,miR828直接作用的靶基因是SlMyb7-like。野生型番茄所测组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高。miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达受缺磷胁迫诱导。在正常供磷和缺磷条件下,miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量和花青素含量均低于野生型,表明miR828通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达,进而负调控番茄植株中花青素的生物合成。miR828能够提高番茄对缺磷胁迫的耐受性。     

家蚕hsp24.3基因的克隆及功能研究

 【目的】对家蚕 hsp24.3基因（Bmhsp24.3）的功能进行研究,为选育抗逆境家蚕品种提供基础材料和理论依据。【方法】在对家蚕基因组进行生物信息学分析的基础上,对家蚕低分子量热激蛋白基因 Bmhsp24.3进行克隆,然后利用家蚕的芯片数据对 Bmhsp24.3基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达模式进行分析,并利用半定量 RT-PCR技术,分别对 Bmhsp24.3基因在正常情况下和热刺激条件下家蚕5龄幼虫不同发育时期（1～6 d）后部丝腺中的表达状况以及10个不同家蚕品种5龄第3天幼虫丝腺中的表达情况进行了检测;最后将 Bmhsp24.3基因进行原核表达,获得重组蛋白 rBmHSP24.3,并进一步对该重组蛋白的功能进行了体外验证。【结果】Bmhsp24.3基因的编码区（CDS）长度为633 bp,编码210个氨基酸,为单外显子基因;RT-PCR检测发现该基因在家蚕的体壁、脂肪体以及丝腺组织中有较高水平表达,在其它组织中的表达不明显;同对照相比,不同家蚕品种以及不同发育时期的5龄幼虫在热刺激后,其后部丝腺中的Bmhsp24.3基因的表达显著升高。经 Native-PAGE和 SDS-PAGE分析表明,在高温条件下,表达获得的重组蛋白rBmHSP24.3能与硫氰酸酶形成稳定的复合物,使底物蛋白免受热刺激胁迫而变性,从而起着分子伴侣的作用。【结论】重组蛋白 rBmHSP24.3在体外具有分子伴侣的功能,推测该蛋白在家蚕体内同样具有分子伴侣的功能,在家蚕的抗逆境适应过程中起重要作用。     

鸡miR-133a靶向调控BIRC5基因的表达

【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5（BIRC5）进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示BIRC5是miR-133a的靶基因,点突变试验证实了miR-133a在BIRC5上结合的靶位点。【结论】miR-133a是与鸡骨骼肌发育高度相关的miRNA,且鸡BIRC5基因是miR-133a的靶基因。     

小鼠胚胎着床相关基因中mir-21靶基因的初步验证

利用microRNA靶位点预测网站结合小鼠胚胎着床芯片数据预测了mir-21的5个与着床相关的靶基因:Reck、F3、Upk1 b、Ggh、Tmed6,通过分别构建含有靶基因3′UTR的重组报告载体、pre-mir-21或/和mir-21inhibitor体外转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定mir-21的靶位点。pre-mir-21可显著降低转染上述5个重组载体的细胞内荧光素酶活性;mir-21 inhibitor可显著增加转染Reck、Upk1 b和Tmed63′UTR的重组载体的细胞内荧光素酶活性;pre-mir-21和mir-21 inhibitor共转染可分别显著增加转染含有Reck3′UTR、F33′UTR、Upk1 b3′UTR和Ggh3′UTR的重组载体的细胞内荧光素酶活性。Reck和Upk1b可能是mir-21的靶基因。     

飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析

 【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。     

家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应

【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1-17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。     

家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用

【目的】bHLH转录因子Bmdimm是家蚕（Bombyx mori）5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现Bmdimm蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基K43,因此推测Bmdimm可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip属于家蚕泛素连接酶E3家族中的U-box亚家族,在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确Bmdimm与Bmchip之间的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析Bmdimm和Bmchip在后部丝腺中的表达情况;分别通过PCR和基因合成获得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白,筛选最优的表达条件;利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签,纯化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝胶过滤层析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集状态;利用圆二色光谱研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二级结构;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在体外的相互作用;利用微量热泳动研究Bmdimm和Bmchip结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示Bmdimm和Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了Bmdimm和Bmchip多种表达载体,发现ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表达载体在16℃,0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导下表达最好,并以此为基础表达纯化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝胶过滤分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在;圆二色光谱显示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋结构; Far-western blotting和Pull-down结果表明Bmdimm和Bmchip可以在体外结合;利用微量热泳动实验计算出Bmdimm和Bmchip结合的平衡解离常数为(750±28.6)μmol·L^-1。【结论】家蚕bHLH转录因子Bmdimm和泛素连接酶Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达,二者可以在体外发生瞬时相互作用,暗示了Bmdimm可能通过Bmchip介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。     

家蚕glial cell missing (BmGcm)基因鉴定、表达、亚细胞定位和功能

【目的】鉴定、克隆家蚕（Bombyx mori）glial cell missing (BmGcm)基因,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究BmGcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmGcm全长cDNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对BmGcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx 和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和qRT-PCR方法检测BmGcm的表达情况。利用原核表达系统获得重组蛋白,通过蛋白纯化和免疫小鼠制备多克隆抗体,运用Western blot对抗体进行检测。构建BmGcm表达载体,转染家蚕胚胎细胞系,分析其亚细胞定位情况,同时利用EDU细胞增殖标记和流式细胞仪对其功能进行探索。【结果】BmGcm（BGIBMGA006182）定位于4号染色体的nscaf2847上,其基因全长 4 046 bp,包含4个外显子和3个内含子。其cDNA全长1 734 bp,包含166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整开放阅读框(ORF)。该基因编码446个氨基酸残基,预测蛋白分子量为50.61 kD,等电点5.557,含有典型的GCM结构域。多重比对结果显示GCM结构域在不同物种间具有高度的保守性,进化分析显示昆虫Gcm蛋白单独聚为一支,其中BmGcm蛋白与帝王蝶同源蛋白亲缘关系最为接近。表达分析结果显示BmGcm在胚胎发育第4天表达达到峰值,随后表达水平逐渐下调,而在幼虫阶段,BmGcm主要表达于中肠、精巢和卵巢。将BmGcm完整的开放阅读框序列构建至原核表达系统,经IPTG诱导和亲和层析纯化获得高纯度重组蛋白,通过免疫小鼠获得了多克隆抗体,Western blot检测该抗体可以特异性识别重组蛋白。在家蚕细胞系中过表达BmGcm蛋白,结果显示其定位于细胞核。在细胞水平,过表达BmGcm会明显抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G1/S期。【结论】克隆鉴定得到Bmgcm全长序列,获得其表达和亚细胞定位信息。通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠制备了可用的多克隆抗体。细胞实验发现BmGcm可以显著抑制增殖和影响正常的细胞周期进程。     

家蚕BmYki-1基因鉴定与表达特征

【目的】Hippo信号通路中的核心激酶通过磷酸化作用于转录共激活因子Yki来调控下游基因的表达,在控制器官大小、细胞增殖与凋亡等方面起关键作用。家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目模式昆虫,对其Hippo通路研究较少。论文旨在通过鉴定家蚕BmYki-1并对其序列信息和表达特征进行分析,为进一步研究中肠中Hippo信号通路提供基础,更好地了解Hippo信号通路在肠道稳态维持及组织损伤修复方面的调控机制。【方法】利用NCBI数据库及家蚕基因组数据库等相关信息,以哺乳动物和果蝇的Yki蛋白序列为依据,对家蚕Yki基因的同源序列进行鉴定;以家蚕大造品系为研究材料,利用PCR和cDNA末端快速克隆技术克隆获得家蚕BmYki两种可变剪切体的全长序列BmYki-1和BmYki-2,并基于生物信息学方法对两种剪切体的基因序列特征及蛋白结构特征进行分析;重点对BmYki-1在家蚕中肠组织中的功能进行探索;利用半定量PCR检测家蚕L5D3不同组织及中肠各个龄期BmYki-1表达情况;构建BmYki-1过表达载体并转染家蚕胚胎细胞系对其进行亚细胞定位分析;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达情况。【结果】家蚕中存在两种可变剪切形式的BmYki,分别为BmYki-1和BmYki-2,在家蚕基因组数据库中对应的注释号分别为BGIBMGA0082-TA和BGIBMGA0081-TA,其开放阅读框(ORF)分别为1 329和1 227 bp,分别编码442和408个氨基酸,其蛋白质分子量分别为48和44.1 kD,等电点分别为5.18和5.50,在139-171、220-252氨基酸处均各有1个WW结构域。多物种进化树表明,家蚕BmYki-1与同为鳞翅目的昆虫脐橙螟的亲缘关系最近,与鞘翅目、膜翅目昆虫较近,与双翅目昆虫较远,而与脊椎动物的亲缘关系最远。结果显示BmYki-1在家蚕中肠和丝腺中特异表达,中肠不同龄期表达谱分析结构显示表达量从2眠开始上调,在5龄的前中期表达水平较高。亚细胞定位试验表明BmYki-1蛋白在家蚕胚胎细胞系中主要存在于细胞核中,但在细胞质中也有分布。与对照相比,用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达量显著上调。【结论】获得了BmYki-1全长序列及时空表达特征,亚细胞定位BmYki-1蛋白主要在细胞核中,推测其在家蚕中肠细胞生长发育及损伤修复中起重要作用。     

褐飞虱Yellow基因的克隆及功能

【目的】克隆褐飞虱（Nilaparvata lugens）Yellow基因（NlYellow）,研究该基因在褐飞虱不同发育时期和不同组织中的表达谱,通过RNA干扰沉默NlYellow了解其功能。【方法】使用网络版primer3设计引物克隆NlYellow,将得到的cDNA序列翻译为氨基酸序列后,与GenBank数据库中其他物种的Yellow序列进行同源比对,并构建系统发育树。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术,研究褐飞虱胚胎、1-5龄若虫以及成虫期NlYellow的相对表达量,并检测该基因在雌、雄成虫头、胸、腹、足、翅、卵巢和睾丸等组织中的相对表达量。向褐飞虱5龄若虫体内注射0.4 µg针对NlYellow的双链RNA,待羽化为成虫后观察表型。【结果】克隆得到NlYellowORF序列,通过序列比对发现它与豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）Yellow的氨基酸序列同源性最高(98%),但与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、家蚕（Bombyx mori）等物种的氨基酸序列同源性较低。系统发育树分析显示它与豌豆蚜的亲缘关系最近。qRT-PCR显示NlYellow在胚胎期表达水平具有波动性,其中第1、3、4和5天中的表达量低于其他时段的表达量。此外,NlYellow在3龄和5龄若虫期表达量高于其他若虫期（P＜0.05）;该基因在雄虫头、胸、翅、足、中肠和睾丸中均有表达,但前4个组织中表达量相对较高（P＜0.05）;而在雌虫中,该基因只在头、胸、翅、足中表达。另外,该基因在短翅成虫中表达水平显著高于长翅成虫（P＜0.05）,并且在短翅成虫当中,雄虫中的表达量高于雌虫并达到显著水平（P＜0.05）。采用RNA干扰技术沉默NlYellow后,褐飞虱成虫整体体色变黄,胸、腹和足颜色变化尤其明显。【结论】初步推测NlYellow的功能是参与外表皮色素沉积,改变体色。     

山羊IGFBP-2基因的克隆、序列分析及其组织表达

【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2（Insulin-like growth factor binding protein -2）基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载NCBI的GenBank数据库中公布的绵羊（Ovis aries,NM_001009436）和牛（Bos taurus,NM_174555）的IGFBP-2基因的mRNA序列,经序列比对后采用保守区域序列并利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物,经PCR扩增后采用TA克隆技术获取含有阳性克隆子的菌液,送公司测序得到山羊IGFBP-2基因的完整编码区序列,并利用EditSeq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和ExPASy在线平台等软件对CDS区序列和其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;获得山羊IGFBP-2基因CDS区序列后,利用该序列设计实时荧光定量PCR（Q-PCR）引物,采用Q-PCR和蛋白质免疫印迹杂交（Western blotting）方法检测了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黄羊不同组织（心脏、肝脏、肺、背最长肌、半膜肌和臂三头肌）和不同发育阶段（3、30、60、90和120 d）的表达情况。【结果】①克隆得到954bp的南江黄羊IGFBP-2基因的CDS区全序列,碱基组成为GC含量69.39%,AT含量30.61%,共编码317个氨基酸残基,预测的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小为33.8808 kD,等电点为7.82,二级结构由无规卷曲（68.14%）、α-螺旋（18.30%）和延伸链（13.56%）三种形式组成;蛋白结构域分析发现,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB（IGFBP homologues）和TY（Thyroglobulin type Ι repeats）结构域,IB结构域位于第37-125位氨基酸处,TY结构域位于第250-302位氨基酸处;②磷酸化位点预测发现,IGFBP-2蛋白中存在Ser（5）和Thr（7）共12个磷酸化位点;糖基化位点预测发现,IGFBP-2蛋白序列中存在10个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点;③CDS区序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;④系统进化树分析发现,山羊IGFBP-2与绵羊和牛的亲缘关系最近;⑤组织表达分析表明,IGFBP-2在肝脏中的mRNA和蛋白的相对表达量均最高(P<0.01),背最长肌次之;在不同发育阶段的肝脏组织中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现一直上升的趋势;在不同发育阶段的背最长肌组织中,IGFBP-2的mRNA表达水平呈现一种“上升-下降-上升”的波动平衡。【结论】获得了山羊IGFBP-2基因完整的编码区序列和组织表达特征,生物信息学分析发现IGFBP-2基因的编码区序列具有物种间的保守性,肝脏是山羊IGFBP-2 的mRNA和蛋白表达的主要组织,同时在山羊不同发育阶段的肝脏和背最长肌组织中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表达丰度呈现一定的规律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生长发育过程中发挥着重要的作用。     

分子连锁分析探讨家蚕高抗BmNPV品系的抗性遗传基础

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)所引发的血液型脓病是一种传染性强的蚕病,极大地影响蚕业生产。本研究旨在定位对BmNPV高抗的家蚕品系中控制其抗性的基因,进而解析其抗性遗传机制,为培育抗性素材和品系提供理论支持。【方法】以BmNPV高抗家蚕品系99R和较感品系Dazao-N为亲本,配制连锁分析(BC_1F)和定位分析(BC_1M)回交群体。首先对两个亲本品系进行浓度梯度添毒,统计感病死亡的家蚕头数,运用SPSS 17.0软件,计算其半致死剂量(LD_(50)),在此基础上确定BC_1分离群体的攻毒剂量,并通过单头定量攻毒,选取感病个体作为连锁定位分析材料;利用筛选得到的覆盖家蚕全套常染色体的多态性标记进行分型,并通过T检验计算各标记与抗性的连锁显著性水平(P值),筛选出与抗性相连锁的标记。在这些标记所在的染色体上加密标记,检测各标记在定位分析群体中的基因型,定位抗性基因。【结果】LD_(50)(99R)=2.92×10~6个多角体/头,LD_(50)(Dazao-N)=9.78×10~5个多角体/头,基于双亲的半致死剂量,选择介于两者之间且略高于其均值的剂量——2×10~6个多角体/头作为BC_1分离群体的攻毒剂量;先后于2014年秋季和2015年春季处理并检测连锁分析群体,前后两次所进行的连锁分析结果有较大差异,其中第一次找到Chr22上的多态性标记S2205与99R抗性连锁,而第二次的连锁分析显示标记S2205与抗性不连锁,也没有找到其他的连锁关系。通过与前人对BmNPV抗性的连锁定位分析结果进行对比,发现连锁定位分析结果的不可重复性是一个普遍的问题。AY380833是GenBank中已公布的在家蚕高抗品系NB和871C中与其抗性位点紧密连锁的分子标记,本研究调查发现其与99R和871C的抗性位点均不连锁。【结论】分子连锁分析结果证明,家蚕对BmNPV的抗性在不同抗性品系中遗传基础有很大的差异性,同一品系可能具有多个抗性位点;家蚕对BmNPV的抗性是一种复杂性状,在符合"质量-数量性状"结论的同时,其数量性状特征突出。     

MiR-433-3p靶向调节绵羊BCKDHB表达

【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-GLO,成功构建BCKDHB 3′-UTR的双荧光素酶报告载体。从公司购买miR-433-3p的过表达载体mimics和阴性对照载体NC,设置miR-433-3p过表达、阴性对照、空白对照3个组,分别将2组载体和双荧光素酶报告载体利用lipofectamineTM3000转染试剂共转染至miR-433-3p过表达、阴性对照组的HEK-293T细胞中,空白对照组中的HEK-293T细胞正常培养,之后分别检测3组细胞中的荧光活性,得到萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性为内参计算萤火虫荧光素酶的相对活性。便于了解miR-433-3p和BCKDHB在绵羊前体脂肪细胞中的调控机制,对采取的绵羊尾部前体脂肪细胞进行离体培养。用过表达miR-433-3p的方法探索miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB的调控,提取过表达miR-433-3p前后细胞的总RNA和总蛋白,利用RT-qPCR检测过表达miR-433-3p前后的miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量、以及利用Western blotting技术检测BCKDHB在过表达前后的蛋白水平。为了解绵羊前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p表达量的变化,用RT-qPCR检测前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p的时序表达。为增加结果的可信度,还对分化过程中不同时段的细胞进行了照片采集和油红O染色。【结果】miR-433-3p在BCKDHB3′-UTR的第8—28个碱基处存在理论上的结合位点。通过比较过表达组,阴性对照组,对照组的相对荧光活性发现过表达miR-433-3p后,BCKDHB 3′-UTR重组双荧光载体的相对荧光活性降低(P0.01),说明miR-433-3p可以与BCKDHB 3′-UTR特异性结合,验证了预测结果的准确性。在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-433-3p后,通过比较过表达组和阴性对照组BCKDHB的m RNA和蛋白的相对表达量,发现过表达组BCKDHB m RNA和蛋白的相对表达量低于阴性对照组(P0.05),说明miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB有负调控作用。在诱导绵羊前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,从采集到的图片和油红O染色的结果发现此过程中脂滴聚积得越来越多,油红O染色验证了脂滴的聚集。另外,在分化过程中检测到miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量呈现负相关关系。【结论】这些结果充分说明miR-433-3p通过与BCKDHB 3′-UTR的结合负调节该基因及其编码蛋白的表达,为进一步研究BCKDHB调节绵羊脂肪代谢的分子机理提供了科学依据。