家蚕microRNA 7靶基因Bmhairy的鉴定和转录表达模式

【目的】micro RNA是一类长约22个碱基的非编码RNA,通过与其靶基因的特异性结合来调控新陈代谢和生长发育等多种生命活动。鉴定家蚕(Bombyx mori)Bmhairy,比较Bmhairy和bmo-mi R-7的表达模式,验证Bmhairy是否为bmo-mi R-7的靶基因,为研究家蚕的变态发育机制提供线索。【方法】用家蚕胚胎反转期的总RNA反转录合成的c DNA模板,克隆Bmhairy编码区(coding DNA sequence,CDS)和3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)并进行序列分析。基于荧光定量PCR和芯片数据比较bmo-mi R-7和Bmhairy的表达模式。利用RNAhybrid和Mi RTif,预测和分析Bmhairy的m RNA 3′UTR上bmo-mi R-7的靶位点。构建荧光素酶报告基因载体,用家蚕胚胎细胞系(Bm E)进行共转染试验,验证bmo-mi R-7对Bmhairy的3′UTR结合位点。【结果】在家蚕中克隆了Bmhairy,含2个内含子和3个外显子,CDS长654 bp,编码217个氨基酸。Bmhairy的m RNA 3′UTR长366nt。Bmhairy高度保守,含有b HLH、ORANGE和WRPW结构域。Bmhairy与鳞翅目(Lepidoptera)蛱蝶科(Nymphalidae)中的黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)相似度最高。Bmo-mi R-7在家蚕胚胎期高量表达,在5龄第3天的精巢中相对较高,而Bmhairy在成虫期的表达量最高,在5龄第3天的头部相对较高。Bmhairy m RNA 3′UTR上有bmo-mi R-7一个靶位点。共转染试验表明,bmo-mi R-7下调Bmhairy。【结论】Bmhairy的家蚕时期表达和5龄第3天组织表达均与bmo-mi R-7的表达呈相反的模式。靶基因预测和双荧光素酶转染试验表明Bmhairy是bmo-mi R-7的靶基因,为进一步研究bmo-mi R-7和Bmhairy在家蚕体内的生物学功能及调控关系提供了依据。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒系统超量表达家蚕let-7簇microRNAs

【目的】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统超量表达家蚕(Bombyx mori)let-7簇(cluster)micro RNAs:bmo-let-7、bmo-mi R-100和bmo-mi R-2795,为研究家蚕micro RNA的功能提供参考。【方法】克隆家蚕let-7 mi RNA簇(bmo-let-7 cluster,bmo-let-7-C)上各mi RNA前体(pri-let-7、pri-mi R-100与pri-mi R-2795)和bmo-let-7-C全长序列,以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因为报告基因,昆虫细胞表达载体p Fast Bac1为穿梭载体,通过Tn7转座子把目的基因和报告基因转座到杆状病毒A.californica nucleopolyhedrovirus(Ac NPV)基因组上,获得各重组杆状病毒质粒(recombinant baculovirus plasmid,r Bacmid):Bac-let-7、Bac-mi R-100、Bac-mi R-2795和Bac-let-7-C。将重组Bacmid转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9,72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测mi RNAs的表达。对转染的Sf9细胞进行离心、收集上清液,获得具感染力的重组病毒,用于侵染新培养的Sf9细胞和注射家蚕幼虫个体,72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测mi RNAs的表达。【结果】成功将bmo-let-7-C上各mi RNA前体和bmo-let-7-C全长序列构建到杆状病毒基因组上,获得了各mi RNA及bmo-let-7-C的过量表达载体。将各重组过量表达载体分别转染草地贪夜蛾细胞系Sf9,72 h后在显微镜下观察到了红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测结果表明各mi RNA显著过量表达;通过离心收集的各mi RNA重组过量表达病毒粒子感染新培养的Sf9细胞72 h后检测到了更强的红色荧光蛋白信号,定量PCR结果表明各mi RNA均显著过量表达。将各mi RNA的重组病毒注射到家蚕5龄1 d幼虫体内后,均能显著超量表达相应mi RNA,但注射Bac-let-7-C后只有mi R-2795显著过量表达,并有明显的组织差异性,在丝腺中没有过量表达,在脂肪体、血液和中肠中显著过量表达。【结论】利用杆状病毒过量表达系统在草地贪夜蛾细胞系Sf9和家蚕个体中超量表达了家蚕let-7簇mi RNAs,为研究家蚕let-7簇和其他mi RNAs的产生机制和功能提供了参考。