盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其特性

以戊二醛法将盐酸克伦特罗 (Clenbuterol,CL)连接到牛血清白蛋白 (BSA)上制备抗原(BSA -CL) ,并以BSA -CL免疫Balb/c小鼠 ,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与NS0细胞融合 ,建立分泌CL单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过对杂交瘤细胞培养上清的检测、鉴定 ,筛选出 1 7株高亲和力的杂交瘤细胞株 ,其中C - 4C9、C - 2D6、C - 4G1和C - 2H6的培养上清ELISA效价为 1∶5 1 2 ,1∶640 ,1∶81 0和 1∶2 5 6;腹水ELISA效价为 5× 1 0 - 6,1 .7× 1 0 - 5,2×1 0 - 6和 3.3× 1 0 - 5。 4株单抗与 β -肾上腺素激动剂沙丁胺醇的交叉反应性为 0 .79% ,与肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素及畜禽常用抗生素无交叉反应性。可以作为制备CL快速检测的特异性单克隆抗体应用     

克伦特罗单克隆抗体的制备及其初步鉴定

【研究目的】制备克伦特罗单克隆抗体（McAb）,为建立克伦特罗残留检测方法奠定基础。【方法】用偶氮化法将克伦特罗与钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）及卵清白蛋白（OVA）偶联,制备完全抗原,免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株以制备单抗,并对单抗的特异性、交叉反应性及抗原识别位点等特性进行了初步鉴定。【结果】获得了1H5、1H7、1D6、2F10四株杂交瘤腹水效价均在1：105以上。对沙丁胺醇交叉反应性测定,最小的是1D6,只有2.32%的交叉反应性。单抗相对亲和力1D6〉1H5〉1H7〉2F10。抗原识别位点分析结果表明,这四株单抗至少识别两个不同的抗原位点。选用1D6初步建立了竞争ELISA检测方法,检测限可达1ng/ml,为进一步研制残留检测试剂盒奠定了基础。     

牛结合珠蛋白α链单克隆抗体制备及辣根过氧化物酶标记

为了制备牛结合珠蛋白主要抗原区重组蛋白(pir Bo Hp)单克隆抗体及对其进行辣根过氧化物标记。试验利用纯化的pir Bo Hp作为免疫原,免疫雌性BALB/c小鼠,然后利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备Bo Hp单克隆抗体。通过Western blot试验分析制备的Bo Hp单克隆抗体的免疫反应性;利用抗体亚型鉴定试剂盒,分析鉴定Bo Hp单克隆抗体的亚型和轻链型。利用改良过碘酸钠标记法,对制备的Bo Hp单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。结果显示,试验成功制备了4株Bo Hp单克隆抗体,分别命名为1B3、6D6、6D3和6B7。Western blot结果显示,制备的4株Bo Hp单克隆抗体1B3、6D6、6D3和6B7能识别牛血浆中天然Bo Hp的α链。进一步抗体亚型鉴定结果表明,1B3、6D6、6D3和6B7抗体亚型均为Ig G1,轻链型为kappa链。利用改良过碘酸钠标记法,对纯化的Bo Hp单克隆抗体1B3、6D6、6D3和6B7成功进行了HRP标记。Bo Hpα链单克隆抗体的制备及其HRP标记为Bo Hp特异性诊断方法的建立奠定了基础。     

多环芳烃-菲单克隆抗体制备及鉴定

为快速、准确检测环境中的菲(Phe),研究制备了抗菲单克隆抗体,并分析了抗菲单克隆抗体的免疫学特性。采用活泼酯法将2-菲丁酸与载体蛋白(BSA、OVA)共价连接制备免疫抗原(Phe-BSA)和检测抗原(Phe-OVA)。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描图谱分析及计算偶联比验证偶联结果。采用足垫法免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术、阳性杂交瘤筛选及克隆制备出抗菲单克隆抗体。结果表明:完全抗原制备成功,获得1株能稳定分泌抗Phe抗体的杂交瘤细胞株1G7,纯化后抗体效价为1∶6.4×105,亲和力常数为3.29×108L/mol。该单克隆抗体亚型为Ig G1,对Phe的IC50值为17.82 ng/m L,与5种多环芳烃具有交叉反应,可用于对环境中多种PAHs的广谱检测。     

微囊藻毒素LR免疫原及包被抗原的合成与鉴定

微囊藻毒素LR(MC-LR)分子量小于1 000 u,为半抗原,需要与载体蛋白偶联后才能刺激免疫应答用于抗体制备。本研究利用碳二亚胺法将MC-LR分别与钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,获得免疫抗原(MC-KLH)和包被抗原(MC-BSA)。采用紫外扫描光谱、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)等3种方法对2种人工抗原进行鉴定,并对小鼠进行免疫。用间接非竞争酶联免疫吸附测定法(ELISA)和竞争ELISA测定了抗血清效价和敏感度。结果表明,紫外扫描光谱法可观察到2种人工抗原的紫外吸收谱与载体蛋白相比发生改变。通过SDS-PAGE法可以观察到MC-BSA分子量比BSA增大。另外质谱法测定的MC-BSA的相对分子量为76 515.84,计算得到的MC-LR与BSA的偶联比为10∶1。MC-KLH免疫小鼠后,抗血清效价最高达到1∶32 000倍,MC-LR对鼠多抗血清的抑制中浓度(I_(50))为0.53μg/mL。成功合成了MC-LR的免疫原和包被原为其单克隆抗体的制备奠定了基础。还比较了3种鉴定方法的适用性和优缺点,为其他人工抗原的鉴定方法提供了有益的参考。     

抗微囊藻毒素胶体金检测试纸条研究

用自制的微囊藻毒素(Microcystin-LR,MC-LR)单克隆抗体与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物为胶体金标记底物研究MC-LR胶体金免疫检测技术。制备各种粒径的胶体金,最终确定粒径30nm的胶体金作为标记抗MC-LR单克隆抗体效果最佳;制备半抗原MC-LR与KLH的偶联物;在硝酸纤维素膜上包被MC-LR与KLH的偶联物作为检测带、包被羊抗鼠IgG作为质控带,建立快速检测MC-LR的免疫层析试纸条方法,该方法在3~5min即可目测判断结果,灵敏度为2ng·mL-1;依据工艺流程,发明制备了微囊藻毒素MC-LR的免疫层析快速检测卡,该卡检测样本中的微囊藻毒素MC-LR含量阈值为2ng·mL-1。     

刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

为获得刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体并初步分析单抗特性,提取刺激隐核虫幼虫膜蛋白,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/O细胞融合,以间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞。通过ELISA方法检测单克隆抗体的亚类及效价;通过SDS-PAGE和western blot分析单抗特异性结合的蛋白,并以串联质谱方法对所识别条带进行鉴定;采用免疫荧光法分析单抗的抗原结合位点和特异性。结果得到3株能稳定分泌刺激隐核虫幼虫膜蛋白抗体的细胞株(5D11AG5、5H9BG3、6E11CE7)。这3株细胞株产生的抗体亚型均为IgM,ELISA效价分别为1∶3200、1∶25600、1∶51200。单抗5D11AG5和单抗5H9BG3株能够识别~35kDa的刺激隐核虫幼虫膜蛋白线性抗原表位,单抗5D11AG5所识别的蛋白与数据库中刺激隐核虫表面抗原蛋白、嗜热四膜虫微管蛋白(tubulin)的肽段具有较高覆盖率。免疫荧光结果显示单抗5D11AG5和单抗5H9DG3识别部位主要在虫体表面近胞口的前端,而单抗6E11CE7识别虫体表面外膜。刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备,为刺激隐核虫功能性蛋白的筛选、纯化和功能分析提供了条件。     

复合免疫制备3种有机磷农药单克隆抗体的技术研究

以α-氨基丁酸和农药中间体为原料合成了甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱3种有机磷农药人工半抗原(H1、H2和H3);通过活泼酯法将H1、H2和H3分别交联于牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备免疫原和包被原.以等体积混合的 H1-BSA、H2-BSA和H3-BSA复合免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体获4株抗上述复合抗原的单克隆抗体,其中甲基对硫磷1株(H9/A3),杀螟硫磷2株(H9/B3、C8/H6),甲基毒死蜱1株(G7/F5).所获4株抗体的类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链,间接ELISA法测定腹水效价均高达1×106.间接竞争ELISA法测定H9/A3、C8/H6和G7/F5细胞株的抑制中浓度(I50)分别为1070、404和752 μg·L-1,且与类似物无交叉反应.本研究建立了一种可在较短的研制周期内,通过单次细胞融合获得多种不同农药的单克隆抗体的有效方法.     

猪流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(MAb),采用差速离心法纯化H1N1和H3N2亚型SIV后交叉免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过建立的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)单克隆抗体检测方法进行筛选。获得3株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为16D5、18G8和20C4,将它们诱导小鼠产生的腹水IPMA效价分别为1×10~(-6)、1×10~(-6)和1×10~(-5)。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链为κ链。3株单克隆抗体特异识别H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亚型流感病毒,并且与猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒无交叉反应。Western blot检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清均在56 ku附近出现一条特异性的蛋白质条带,说明针对SIV的NP蛋白制备了3株单克隆抗体。综上,成功制备了针对SIV NP蛋白的3株单克隆抗体,可识别不同亚型的SIV。     

猪脂肪细胞膜单克隆抗体的制备

利用分离纯化的猪脂肪细胞膜蛋白在福氏完全佐剂中乳化 ,经皮下 (腹膜内 )免疫BALB/C小鼠。取脾细胞与SP2 /0骨髓瘤细胞进行融合 ,经筛选及克隆 ,成功地建立了 4株可分泌抗猪脂肪细胞膜蛋白单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞 2D3 、2D4、3F6、3E7,其中以 3E7稳定性最好 ,血清抗体效价为 1 0 3 ,此杂交瘤细胞株传代培养 2～ 3个月以上 ,ELISA检测抗体滴度无明显降低。     

抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10~5～1.02×10~6;IPMA效价分别为6.40×10~4、1.28×10~5、2.56×10~5、1.28×10~5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10~4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。     

基于3 种载体蛋白的莱克多巴胺抗原的合成与检测

为制备高效莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)抗体,将人工合成的RAC-琥珀酸酯半抗原与3种载体蛋白(BSA、OVA和KLH)偶联合成人工抗原,采用紫外光谱扫描、测定偶联比和ESI-MS进行鉴定;通过免疫小鼠获得抗血清,采用ELISA比较其效价,对3种人工抗原的免疫原性进行评定,结果显示3种抗血清效价为4000~32000,表明合成的3种人工抗原都具有免疫原性,其中以KLH为载体蛋白的抗原的免疫效果较好,可用于制备高效RAC抗体。     

抗大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体制备

【目的】制备大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体,为大片吸虫病的免疫诊断、防治等研究奠定基础。【方法】利用杂交瘤技术,以大片吸虫分泌排泄抗原为免疫原制备单克隆抗体,并用ELISA、硫氰酸盐洗脱法等方法鉴定其生物学特性。【结果】通过间接ELISA筛选及3次亚克隆后,共获得5株大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6D3、6B4、7D2、7D1和7D4。经鉴定,发现5株杂交瘤细胞染色体数为90～110条,均大于亲本细胞,其亚类鉴定分别属于IgG2b、IgM、IgM、IgG1和IgM,其轻链均为κ型;5株单克隆抗体（6D3、6B4、7D2、7D1、7D4）的上清效价分别为1∶400、1∶3200、1∶25600、1∶6400和1∶6400,腹水效价分别为1∶104、1∶104、1∶105、1∶107和1∶106;而表位测定结果表明,5株单克隆抗体中,6D3与7D1、7D2以及7D4与7D1、7D2作用于不同表位,6D3与6B4 可能识别同一表位或重叠表位,或同一表位有空间位阻,7D4与6D3以及6B4与7D4、7D1、7D2可能具有空间位阻;5株单克隆抗体的相对亲和力为：6B4＞7D4＞7D1＞6D3＞7D2;5株杂交瘤细胞株均能稳定地分泌单克隆抗体。【结论】制备获得的分泌排泄抗原单克隆抗体可用于大片吸虫病的诊断和免疫机理等方面的进一步研究。     

抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的单克隆抗体(Mab),以原核表达的融合蛋白GST-N为免疫原,免疫7周龄雌性BALB/c小鼠,利用重组蛋白His-N和Vero细胞培养病毒液作为检测筛选抗原,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果表明:获得3株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(5B2,3H1和4H5),单抗亚型鉴定均为Ig G1,轻链均为Kappa链。Western blot和间接免疫荧光试验结果表明,Mab能够识别重组N蛋白和PEDV。制备获得3株稳定性好、特异性强的Mab,可为今后建立检测猪流行性腹泻特异性诊断方法和研究PEDV核衣壳蛋白功能奠定基础。     

抗红鳍东方鲀皮肤溃烂病病原哈维弧菌单克隆抗体的制备及特性分析

以红鳍东方鲀皮肤溃烂病病原——哈维弧菌2SYX002为抗原,通过杂交瘤技术制备了抗哈维弧菌的单抗1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6和2C1。特性分析结果表明:有8株单克隆抗体(1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6、6G6)特异性较差,与试验中所有菌株均发生反应;有6株(4A7、4E12、7D7、8E10、4D12、2B9)只与免疫菌株哈维弧菌2SYX002反应,与其他菌株均不发生反应。5株单抗(2E7、5B2、1G2、2C1、1G3)与部分参考菌株有不同程度交叉反应;通过进一步特性分析,从中筛选出单克隆抗体2C1,其抗原包被浓度为5×107 cells/m L时,与试验中所有哈维弧菌分离株反应均为阳性,除溶藻弧菌外不与其他参考菌株发生交叉反应,效价为1:256。本研究扩充了哈维弧菌单克隆抗体库,为哈维弧菌单克隆抗体的进一步应用提供参考数据。     

木薯钙调蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

钙调蛋白(CaM)作为重要的抗逆信号转导蛋白,在调控木薯抗逆境和块根采后生理腐烂中起重要作用,为给快速检测木薯在不同生长环境中CaM蛋白的表达水平提供优良抗体,克隆木薯CaM基因并将目的基因插入原核表达载体,经Escherichia coli表达并纯化,用纯化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能产生抗CaM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用Western blot、ELISA等方法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Western blot分析结果显示原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达CaM,免疫小鼠后取效价高的2#小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,共获得7株效价均达到106以上、能稳定分泌抗CaM抗体的细胞株,这7株单抗与淀粉磷酸化酶、His、BSA均无交叉反应,4D5株与标签蛋白ACP有交叉反应,表明其余6株均为CaM特异性抗体;抗体亚型鉴定结果显示7株单抗均为IgG型抗体。     

用抗血清建立克伦特罗ELISA检测方法及其应用研究

为建立克伦特罗(CL)酶联免疫吸附试验检测方法,采用重氮偶联法将CL与牛血清白蛋白(BSA)偶联,经多次加强免疫BALB/C小鼠,获得抗血清.经检测表明,抗血清效价为128 000,和莱克多巴胺(Rac)、沙丁胺醇(Sal)交叉反应率为0.1%,具有很强的特异性.用CL抗血清建立了CL间接竞争ELISA法,得到标准曲线的回归方程logit y=-0.8756x+1.6958,相关系数为0.995,可检测范围为1 ng/mL～10 μg/mL,并检测出饲喂了含CL饲料的猪的尿样中含有CL.     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化鲤春病毒血症病毒( SVCV) G蛋白,制备特异性单克隆抗体,扩增出鲤春病毒0504分离株G基因片段,并将其克隆至原核表达载体pET-28a (+)中,经诱导表达、裂解离心包涵体,包涵体经His Bind亲和层析柱纯化及尿素浓度梯度复性后,作为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。结果表明：成功筛选出2株稳定分泌G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1 C5、2 D5,经Western-Blot检测表明,制备的单克隆抗体具有良好的特异性。本研究中成功制备的抗G蛋白单克隆抗体,可为建立新型鲤春病毒检测方法提供工具。     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。