紫外分光光度法测定澳洲茄胺盐酸盐含量

研究了用紫外分光光度法测定龙葵平喘胶囊和AD-1注射剂中澳洲茄胺盐酸盐（SHBL）含量的方法．结果表明,澳洲茄胺盐酸盐在75％的甲醇溶剂中波长λmax=204nm处有最大吸收;澳洲茄胺盐酸盐对照品溶液的线性回归方程为Y=-0．274＋8．726x,r=1．002,加标回收率为92．0％～100．1％（n=9）．     

澳洲茄胺盐酸盐对小鼠肝癌H22抑制作用研究

目的研究观察澳洲茄胺盐酸盐对移植性实体型肿瘤小鼠肝癌H22的瘤重抑制率.方法本项研究采用肿瘤细胞悬液接种法制备小鼠移植性实体型肿瘤H22动物模型.腹腔注射给药,连续10 d.给药结束后,解剖小鼠,取瘤称质量,进行统计学处理及分析,观察药物作用,连续3次重复实验.结果经过研究发现：澳洲茄胺盐酸盐对移植性实体型小鼠肝癌H22抑制实验3次重复实验证实,在药物倍数剂量设置下,44 mg/kg剂量组与盐水对照组比较,有显著性差异;44 mg/kg剂量组瘤质量抑制率在55.1%～73.7%之间,平均抑瘤率为62.3%,P〈0.01.结论通过连续3次重复实验,澳洲茄胺盐酸盐对小鼠移植性实体型肿瘤肝癌H22有明显的抑制作用.     

三氧化二砷对人宫颈癌HeLa细胞凋亡及其血管内皮生长因子表达的影响

目的了解三氧化二砷（As2O3）对人宫颈癌HeLa细胞凋亡及其血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法用不同浓度的As2O3作用于HeLa细胞不同时间段后,光镜和电镜观察细胞形态改变,MTT法测定细胞生长抑制情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting方法检测VEGF的表达。结果不同浓度的As2O3处理HeLa细胞不同时间后,能抑制宫颈癌Hela细胞的体外生长,诱导宫颈癌Hela细胞凋亡,并呈浓度和时间依赖性（P〈0.01）。As2O3还下调VEGF的表达。结论 As2O3可抑制体外人宫颈癌HeLa细胞增殖及VEGF的表达。     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因的融合表达

禽流感病毒（AIV）非结构蛋白NS1在病毒粒子中不存在，因此，可以通过检测NS1抗体来鉴别禽流感病毒感染鸡群和免疫鸡群．将ns1基因和T4噬菌体soc基因在大肠埃希氏菌中融合表达，融合蛋白可以作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原．采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的ns1基因（654bp）；将该片段克隆至pSOC质粒soc基因3’端，成功构建了重组质粒pSOC-NS1，用该重组质粒转化EcoliB121（DE3）感受态细胞，以终浓度1mmol／mL的IPTG诱导表达．SDS-PAGE结果表明pSOC-NS1融合蛋白相对分子质量约39000．Western-blot证实，表达产物与AIV H9N2病毒感染的小鼠血清具有良好的反应性．     

小鼠早期胚胎发育过程中胚胎发育相关功能基因mRNA的表达

运用半定量RT-PCR技术对候选功能基因在表达水平上检测不同交配组合胚胎早期发育过程中存在的差异,选取正常DDK品系小鼠和BALB/c品系小鼠,进行不同组合交配.选取8个功能基因EGF,EGF-R,TGF-α,Bcl-2,Mcl-1,C-myc,H-ras,LIF作为候选基因.结果表明,在2细胞期有EGF,Bcl-2,Mcl-1 3个基因进行表达,且3个基因表达差异显著(P＜0.05);在4细胞期有6个基因进行表达,EGF,Bcl-2,Mcl-1,EGF-R 4个基因表达差异显著(P＜0.05);在8细胞期有7个基因进行表达,EGF,Bcl-2,Mcl-1,EGF-R 4个基因表达差异显著(P＜0.05).杂交胚胎从8细胞期之后即桑葚期开始发生凋亡现象,因胚泡形成障碍,而导致胚胎早期死亡;候选基因中Mcl-1,Bcl-2,EGF,EGF-R基因在胚胎细胞中表达量差异显著(P＜0.05),并且与正常胚胎相比杂交胚胎中差异基因的表达均下调,这些基因表达水平的下调可能间接地引发早期胚胎致死现象.     

视黄酸及干扰素对胃癌细胞系MKN45中p16,p21,c-myc基因表达的影响

目的探讨全反式视黄酸及干扰素两种因子对胃癌MKN45细胞的影响.方法将视黄酸及干扰素同时加入胃癌细胞系MKN45中进行细胞培养,用MTT法测定细胞的生长状况,并通过Northern blot和免疫组化测定p16,p21及c-myc的表达情况.结果干扰素（IFN）协同全反式视黄酸（ATRA）可有效地抑制MKN45细胞生长,癌细胞经联合用药诱导后p16和p21基因的表达水平提高,c-myc基因表达水平下降.视黄酸受体RARα基因在MKN45细胞中呈低水平表达,经ATRA和IFN诱导后表达水平提高.结论 ATRA联合IFN诱导可调节p16和p21基因的表达水平,抑制胃癌MKN45细胞生长,这可能与细胞中RARα基因高水平表达有一定关系.     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

过表达沙门氏菌效应蛋白SopB对HeLa细胞骨架的影响

[目的]研究沙门氏菌感染宿州细胞过程中,沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的效应蛋白SopB对宿主细胞细胞骨架的影响,同时寻找SopB蛋白调控细胞骨架变化的相关结构域。[方法]利用基因克隆的方法分别构建含鼠伤寒沙门氏菌LT2效应蛋白SopB的全长基因、SopBN末端基因片段及SopB肌醇磷脂酶活性中心氨基酸C460突变体的重组质粒,使其均在HeLa细胞中过量表达,对表达结果进行检测。[结果]SopB重组质粒在HeLa细胞中均能正常表达,其中SopB蛋白的过表达能显著改变HeLa细胞的细胞骨架,使细胞由正常的细胞形态转变为圆形。[结论]通过比较SopB各基因片段对细胞形态的影响,发现SopB过表达在改变HeLa细胞骨架方面与其N末端第46～112位氨基酸残基间的肽断直接相关,而与其肌醇磷脂酶活性关系不大。     

沉默SOCS3对TNF-α诱导3T3-L1前体脂肪细胞凋亡的抑制作用

【目的】运用si RNA沉默小鼠前体脂肪细胞3T3-L1的细胞信号负调控因子3基因(SOCS3),探讨SOCS3在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导3T3-L1细胞凋亡中的作用。【方法】体外培养3T3-L1细胞,用0,20,40,60,80,100,150,200 ng/mL TNF-α处理细胞24 h后,观察细胞凋亡情况。利用脂质体LipofectamineTM2000,用化学合成的SOCS3小干扰RNA(si RNA)转染3T3-L1细胞,用100 ng/mL TNF-α刺激24 h,荧光显微镜下观察细胞凋亡的变化,RT-PCR检测SOCS3、c-myc和survivinmRNA的表达情况。【结果】SOCS3 si RNA抑制了3T3-L1细胞中SOCS3 mRNA的表达(P<0.05)。与空白对照组相比,SOCS3 si RNA组的SOCS3 mRNA表达量极显著减少,c-myc和survivinmRNA的表达水平极显著或显著升高,而脂质体组和阴性对照组无显著差异。【结论】体外试验结果证明,靶向抑制SOCS3基因表达可以有效抑制TNF-α诱导的3T3-L1细胞凋亡。     

角果木内生真菌活性分子对HeLa细胞增殖凋亡的影响

为了解红树林植物角果木(Ceriops tagal)内生壳囊孢属真菌Cytospora sp.提取物WP-1［(22E, 24R)-5, 8-epidioxy-5α, 8α-ergosta-6, 9(11), 22E-trien-3β-ol］抑制人宫颈癌HeLa细胞的效果，笔者采用MTT比色法、克隆形成实验、Hoechst 33258染色和蛋白免疫印迹法来研究WP-1对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，随着WP-1浓度增加，HeLa细胞的存活率显著降低，而且该提取物能明显抑制HeLa细胞的克隆形成，当其浓度达到10 μmol·L?1时，HeLa细胞出现染色质浓缩以及核小体碎裂的凋亡现象。蛋白免疫印迹法结果显示，随着WP-1剂量的增加，与凋亡相关的蛋白Caspase-3及Caspase-9的表达下调，Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9的表达明显上调。本实验结果显示，WP-1可以抑制HeLa细胞的增殖，并促进HeLa细胞发生凋亡。     

三肽囊素抗独特型抗体可变区基因库的建立

利用抗bursin单克隆抗体免疫SPF来航鸡，获得抗独特型抗体的产生细胞，从中提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，根据鸡抗体重、轻链基因设计引物，进行PCR扩增。在体外成功地扩增出该抗体的可变区重链和轻链基因。     

Microinjected c-myc as a competence factor

While a number of oncogenes are expressed in a cell cycle-dependent manner, their role in the control of cell proliferation can only be established by a direct functional assay. The c-myc protein, upon microinjection into nuclei of quiescent Swiss 3T3 cells, cooperated with platelet-poor plasma in the stimulation of cellular DNA synthesis. This suggests that c-myc protein, like platelet-derived growth factor (PDGF), may act as a competence factor in the cell cycle to promote the progression of cells to S phase. The presence in the medium of an antibody against PDGF abolished DNA synthesis induced by microinjected PDGF; however, the microinjected c-myc protein stimulated DNA synthesis even when its own antibody was present in the medium. The c-myc protein may act as an intracellular competence factor, while PDGF expresses its biological activity only from outside the cells.     

分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立

用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）感染ＭＤＢＫ细胞,将感染细胞培养物冻融后离心取上汪经ＰＥＧ沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清抗体效价高遥免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在ＰＥＧ作用下融合,产生杂交瘤细胞,用间接ＥＬＩＳＡ法检测杂交瘤细胞生长孔上清,筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀法克隆２－３次,得到８ 泌抗ＢＶＤＶ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株。８株ＭｃＡｂ对ＢＶＤＶ,猪瘟均呈阳性反应。杂交     

哺乳动物促卵泡素氨基酸序列特征及其单克隆抗体的制备与鉴定

为制备哺乳动物促卵泡素(FSH)单克隆抗体,比对了人类、家畜、部分野生动物、鼠类等哺乳动物FSH氨基酸序列,分析其种间同源性,结果发现,多种哺乳动物FSHβ亚基氨基酸序列的同源性高于80%,且线性抗原表位高度保守。从奶牛垂体组织扩增FSHβ亚基CDS片段,构建p ET28aFSH重组质粒,诱导表达FSH重组蛋白,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞孔,取效价最高孔进行克隆和亚克隆,获得1株能够分泌抗FSH的单克隆抗体细胞株,命名为B4A5。B4A5细胞株经过数次传代培养、反复冻融后生长状态良好,且能够稳定分泌抗体。采用细胞株体外培养和小鼠腹水诱生法均制备了抗FSH的单克隆抗体,其效价分别为1∶640、1∶106。分别采用Western blot和间接ELISA法鉴定单克隆抗体的结合特异性和交叉反应性,结果显示,制备的单克隆抗体与FSH反应呈阳性,与促黄体素(LH)、促甲状腺素(TSH)、促乳素(PRL)、人绒毛膜促性腺激素(h CG)均无交叉反应性。综上,获得了1株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体可特异性结合FSH蛋白。     

Preparation of Monoclonal Antibody Against PthA-NLS and Cloning of the Relative ScFv Gene

The present study aimed at the preparation of monoclonal antibody against the recombinant PthA-NLS and the isolation of the relative ScFv （single chain variable fragment） genes, providing the possibility to better understand the pathogenesis mechanism via PthA, and developing proper construct for future experimentation to obtain citrus plants resistant to canker disease by transformation and plant antibody techniques. The recombinant polypeptide PthA-NLS was injected into Balb/c mice to produce monoclonal antibody. Total RNA was isolated from the hybridoma cell line 3D10H2 which secreted anti- PthA-NLS McAb, and the variable region genes were amplified with specific primers by RT-PCR and SOE-PCR （splicing by overlap extension）, and then the ScFv gene was isolated. The recombinant ScFv gene was cloned into pGEM-T and pET32a（＋） vector. The later plasmid was transferred into E. coli BL21 （DE3） and the expression of the recombinant protein was induced. Three cell lines producing monoclonal antibody against PthA-NLS were acquired and named 1C8H1, 2D12B6, and 3D8A10. The recombinant ScFv gene of about 750 bp was constructed. The sequencing results showed that the ScFv gene consists of a 360 bp heavy chain, a 342 bp light chain, and a 45 bp linker region. The recombinant fusion ScFv protein was expressed by IPTG induction, and a 44.5 kDa of recombinant fusion protein was obtained. In conclusion, we obtained three cell lines stably producing monoclonal antibody specifically bound to PthA-NLS, and the relative ScFv gene was constructed and successfully expressed in E. coli. These results may play an important role in further understanding the pathogenesis mechanism and in the development of possible citrus resistant to canker disease by genetic transformation and plant antibiobody.     

小鼠B7-1转基因肿瘤疫苗的制备及其评估

目的：评估导入B7-1基因的肿瘤细胞能否作为肿瘤疫苗治疗膀胱肿瘤。方法：采用脂质体Lipofectamin 2000 （Lip2000）将B7-1基因导入鼠膀胱肿瘤（MBT-2）细胞。细胞表面分子的表达经免疫荧光染色而测得。采用混合淋巴细胞培养MTT法．观察MBT-2-B7-1细胞刺激脾淋巴细胞增殖情况。通过动物实验测定该细胞的肿瘤形成能力。结果：当Lip2000与DNA的比值不低于4：1时能有效地转染MBT-2膀胱肿瘤细胞。转染了B7-1基因的肿瘤细胞能有效地刺激脾淋巴细胞的增殖,并在体内明显延迟了肿瘤的发生;肿瘤的生长也明显受到抑制。结论：B7-1转基因肿瘤细胞可能是制备良好膀胱肿瘤疫苗的细胞。     

Production and Identification of High Affinity Monoclonal Antibodies Against Pesticide Carbofuran

To produce high-affinity monoclonal antibodies against pesticide carbofuran, and the develop immunochemical assays for people＇s health and environmental protection, the hapten 4-[[（2,3-dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyloxy） carbonyl]- amino]-butanoic acid （BFNB） of carbofuran was synthesized and Balb/c mice were immunized by the hapten-carrier （BFNB-bovine serum albumin, BFNB-BSA） conjugates. The splenocytes of immunized mice were fused with Sp2/0 cells and the cultural supernatants of hybridoma cells were screened by the indirect enzyme-linked immunoabsorbent assay （ELISA）, based on BFNB-ovoalbumin conjugates （BFNB-OVA）. Purified monoclonal antibody （McAb） was obtained from fluids of ascites, deposited by octanoic acid and ammonium sulfate. The affinity and the specificity of McAb were characterized by ELISA or indirect competitive ELISA. A hybridoma cell line （5D3） secreting anti-carbofuran McAb had been established. The titer of culture medium and ascites was up to 1：2.048 × 10^3 and 1：1.024 × 10^6, respectively, and the subtype of the McAb was IgG1. The affinity constant of the McAb was about 2.54 × 10×9 L mol^-1, with an IC50 value of 1.18 ng mL^-1 and a detection limit of 0.01 ng mL^-1. Cross-reactivity studies showed that the McAb was quiet specific for carbofuran, as among the four analogous compounds, they were all hardly recognized （4.59 × 10^-4% for 2,3-dihydro-2,2- dimethyl-7-benzofuranol and less than 3.0 × 10^4% for others）. The prepared McAb had a very high affinity and specificity, and it could be used to develop ELISA for rapid determination of carbofuran.     

KGF-2单克隆抗体间接ELISA筛选方法的建立

目的建立KGF-2单克隆抗体间接ELISA的筛选方法 ,制备KGF-2单克隆抗体.方法以KGF-2为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.通过棋盘滴定方法确定间接ELISA的抗原包被浓度及一抗、二抗最佳工作浓度;利用建立特异性好的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株.结果通过棋盘滴定最终确定了500μg/L的抗原包被浓度、1∶1 000的一抗血清稀释倍数及1∶2 000的二抗血清稀释倍数;筛选到两株可稳定分泌抗体、效价较高的杂交瘤细胞株.结论该研究建立了灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于KGF-2单克隆抗体的制备及检测.