山羊疣状毛癣菌鉴定与敏感天然药物的体外筛选试验

为鉴定一次黑山羊养殖场暴发的皮肤癣菌病原,采集患病羊病变皮屑进行病源分离,对分离的真菌进行形态学鉴定和ITS序列分析,并采用CLSI M38-A2微量稀释法筛选敏感天然药物。结果表明:分离的真菌菌落形态、孢子和菌丝结构与疣状毛癣菌相符,其ITS序列(登录号:KX619436)与Pchelin公布的T.verrucosum(登录号:KU378220)同源性最高,达99.99%;18味天然药提取物对分离真菌最低抑菌浓度和最低杀菌浓度试验表明,知母的抗菌效果最好(40 mg/m L,160 mg/m L)。这表明,引起该养殖场黑山羊皮肤癣菌病的病原为疣状毛癣菌,知母为该分离菌的最佳敏感天然药。     

广东花生果腐病病原菌鉴定及药剂筛选试验

【目的】鉴定广东花生果腐病病原菌类型并筛选有效的杀菌剂种类,为生产上防控该病害提供参 考。【方法】采用组织分离法从大田采集的患病花生果荚中分离获得果腐病的真菌纯培养物,回接验证分离菌 株的致病性后确认其病原,通过克隆菌株的 ITS 序列并进行系统发育分析鉴定病原菌种类。采用菌丝生长速率 法测定 40% 福美双水悬浮剂、98% 噁霉灵可溶性粉剂、24% 井冈霉素 A 水剂、10% 苯醚甲环唑水分散粒剂和 10% 多抗霉素可湿性粉剂对该病原菌的抑菌效果。【结果】 从韶关采集的花生果腐病样本中分离获得 2 株病原 真菌,回接后均可以引起花生果荚腐烂,严重时导致果仁腐烂。基于菌株 ITS 序列的系统发育分析显示病原菌 为尖孢镰刀菌（Fusarium oxyspourm）和茄病镰刀菌（Fusarium solani）。供试杀菌剂中 40% 福美双悬浮剂对 2 种病原真菌的抑菌效果最好,EC50 分别为 0.001 mg/L 和 0.021 mg/L,其次是噁霉灵,EC50 分别为 0.296 mg/L 和 0.217 mg/L,井冈霉素 A 的 EC50 分别为 20.575 mg/L 和 11.185 mg/L,苯醚甲环唑和多抗霉素对 2 株病原真菌没有抑菌 效果。【结论】广东韶关地区花生果腐病主要由镰刀菌复合感染引起,以茄病镰刀菌为主,病原菌对福美双和 噁霉灵敏感,生产上可以考虑使用这两种杀菌剂防控。     

西藏3种疯草中合成苦马豆素内生真菌的鉴定

 【目的】从西藏毛瓣棘豆、冰川棘豆、茎直黄芪中分离内生真菌。【方法】应用薄层色谱法、气相色谱、气相色谱-质谱联用法检测内生真菌中的苦马豆素（swainsonine,SW）,筛选可生成SW的内生真菌;应用聚合酶链反应对真菌的ITS序列和IGS序列进行扩增,并根据ITS序列信息构建系统发育树,确定其种属分类;对IGS序列进行限制性酶切,并分析酶切产物。【结果】从3种疯草中分离到可以产生SW的4株内生真菌,各菌的形态、ITS序列的同源性与埃里格孢属真菌较为接近,系统发育分析表明4株真菌均为棘豆埃里格孢菌。ITS序列和IGS序列的限制性片段的分析表明,4株真菌遗传距离较近,但仍存在种间变异,可能为棘豆埃里格孢菌的不同亚种。【结论】本研究结果为探讨内生真菌合成SW机理研究奠定了基础,为动物疯草中毒病的防除和疯草资源的合理利用提供了新思路。     

贮藏苹果中展青霉素产生菌的分离及其ITS序列分析鉴定

【目的】分离贮藏苹果中的展青霉素产生菌,并对其ITS序列进行分析鉴定。【方法】从贮藏库中苹果上分离展青霉素产生菌,采用真菌ITS区特异性引物对其ITS区进行PCR扩增测序,将分离菌ITS区序列与GenBank中的核酸数据库进行比对分析,确定展青霉素产生菌的生物学分类,并对其亲缘关系进行系统发育分析。【结果】共分离得到10株展青霉素产生菌,其中1号和8号菌株属曲霉属,其他8株属青霉属。在系统发育关系上,1号和8号菌为一个类群,其他8株菌属于一个类群。【结论】贮藏苹果中分离得到的10株展青霉素产生菌为青霉属或曲霉属菌株,它们之间存在着不同程度的亲缘关系。     

应用宏基因组测序开展银黑狐真菌皮肤病分子流行病调查

毛皮动物的皮肤真菌病也称癣病,是由于真菌感染皮肤、被毛后所致的疾病。主要症状是患部断毛、掉毛或出现圆形脱毛区,皮屑较多。该病是一种接触性人兽共患病。本研究以银黑狐真菌病患病皮肤样本为基础,以真菌内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)为靶标序列,应用宏基因组测序方式,对样本中所有真菌样本的ITS进行序列测定和生物学统计。结果显示,检测出致病真菌苯黑末节皮真菌(Arthroderma benhamiae),并且为优势菌株;基于ITS基因的系统发育树分析显示,样本内的真菌呈现出多样性特征,且苯黑末节皮真菌与发菌科(Trichocomaceae)在拓扑分类学上近似。     

肉牛源毛孢子菌Trichosporon loubieri的分离鉴定与药敏试验

为探究肉牛真菌性皮肤病的病因并有效防治该病。取发生皮癣病肉牛患部的皮屑、被毛进行真菌学检查和分离。采用沙保弱氏培养法对皮屑和毛发样品进行分离纯化。对分离株进行形态学、分子生物学鉴定和小鼠致病性、药敏试验。最终从样本中分离到一株真菌(编号zrfg01)。对分离株进行PCR扩增,获得长度为542 bp的转录基因间隔区(intergenic spacer,IGS)序列片段,序列提交GenBank,获得序列号为MF401393.1。序列在Blast中比对结果显示,zrfg01与编号KT936593.1的Trichosporon loubieri的相似性为100%。根据形态学和分子生物学方法将其鉴定为T. loubieri。动物实验表明该菌对小鼠有选择性致病作用。药敏试验表明,该菌在25 ℃环境条件下,对特比萘芬和氟胞嘧啶耐药,对克霉唑、两性霉素B、氟康唑、伏立康唑较为敏感。该研究可为诊断和治疗T. loubieri引起的肉牛皮肤癣菌病提供重要参考。     

进口奶牛皮肤真菌病病原疣状毛癣菌的分离鉴定

为了解进口奶牛皮肤真菌病的病原情况,选择2013-2014年河北进口的具有不同程度皮肤真菌病症状的奶牛,刮取病灶处皮屑样品34份,进行病原分离,并通过形态学和DNA条形码方法进行鉴定。结果表明,共分离得到17株真菌,其中10株被鉴定为人畜共患性真菌——疣状毛癣菌。这为进一步了解中国进口种牛皮肤真菌病病原,开展有效治疗,探索疫苗免疫方案以及预防从业者感染奠定了基础。     

广西桉蝙蛾病原真菌的鉴定

【目的】进行广西桉蝙蛾病原真菌的种类鉴定,筛选致病性强的优势菌株,为桉蝙蛾的生物防治奠定基础。【方法】采用常规的组织分离法进行病原菌的分离,对分离纯化获得的菌株进行致病性测定,根据形态特征和rDNA ITS序列分析确定病原菌的分类地位。【结果】从桉蝙蛾虫尸上分离纯化获得206个真菌菌株,这些菌株分属于白僵菌（Beauveria）、镰刀菌（Fusarium）、拟青霉（Paecilomyces）、曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）和Evlachovaea,其中白僵菌分离率为87.4%,其他真菌分离率较低。经致病性测定,白僵菌是桉蝙蛾幼虫强致病菌,镰刀菌和Evlachovaea是弱致病菌,其他4类真菌为非致病菌。以形态学特征和rDNA ITS序列分析结果为依据,鉴定球孢白僵菌[B.bassiana（Balsamo）Vuillemin]、尖孢镰刀菌（F.oxysporum Schlecht）和Evlachovaea sp.为桉蝙蛾幼虫的致病菌,其中Evlachovaea sp.在中国首次被记载。【结论】广西桉蝙蛾的病原真菌为球孢白僵菌、尖孢镰刀菌和Evlachovaea sp.,其中球孢白僵菌为优势菌,具有较高的开发利用价值。     

北京昌平区食用百合根及鳞茎腐烂的病原菌分离与鉴定

【目的】明确引起北京昌平区食用百合根及鳞茎腐烂的病原菌种类。【方法】采用PDA培养基对采集自田间的食用百合腐烂发病的根及鳞茎组织进行病原菌分离纯化,对真菌分离物进行孢子形态观测,结合ITS序列分析和致病性测定,对病原真菌进行鉴定。【结果】从发病组织上共分离纯化得到18株真菌分离物,经鉴定,其中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)12株,角担菌属(Ceratobasidium spp.)真菌分离物6株,室内与田间致病性测定结果表明,尖孢镰刀菌(F.oxysporum)为引起百合根及鳞茎腐烂的致病菌。【结论】造成北京昌平地区食用百合根及鳞茎腐烂病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。     

犬 猫皮肤癣菌病的诊治

<正>1皮肤癣菌病的病原1.1皮肤癣菌病是一群形态、生理、抗原性上关系密切的真菌,按大小分生孢子的形态可分为3个属:毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属,约40余个种,其中约20余种能引起人或动物的感染。引起犬、毛皮肤癣菌感染的病原主要有:犬小孢子菌,石膏样小孢子菌和须毛癣菌等。1.2根据皮肤癣菌的自然寄居特性,可分为3类:亲动物性,主要侵犯动物,也可引起人感染皮肤癣菌病,如犬小孢子菌和须毛癣菌即属此类;亲人性,主     

蓝莓炭疽病病原菌鉴定及致病性测定

【目的】鉴定辽宁省部分地区疑似炭疽病的蓝莓病株的病原,为蓝莓病害的防控及抗病育种提供依据。【方法】对采自辽宁省兴城市和庄河市的疑似炭疽病的蓝莓发病枝条及叶片进行组织分离、培养,从所分离获得的两类菌株中选择形态学不同的代表菌株LNSW1和B-Cg1进行后续试验和分析。观察两个代表分离菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）上的菌落及分生孢子的形态特征。对代表菌株LNSW1和B-Cg1的真菌核糖体基因进行PCR扩增和测序,采用Mega5.1软件中邻位加入法（neighbor-joining,NJ）进行基于病原菌rDNA-ITS基因序列和GenBank中已有相关炭疽菌序列的系统发育树构建。利用尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）和胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）的特异性引物对CgInt2/ITS4和CgInt/ITS4对代表菌株进行特异性扩增,采用菌丝块叶片接种法对8个蓝莓品种进行代表分离菌株的致病性测定。【结果】从辽宁省部分蓝莓产区罹病植株上共分离纯化得到36个菌株,根据各菌株的形态学差异将其分成两个类别,两类别中代表菌株LNSW1和B-Cg1在菌落颜色及分生孢子形态上具有较大差异,且与已报道的炭疽菌属当中的尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌形态特征相似;两个代表分离株的rDNA-ITS序列实际长度为557和547 bp,通过基于真菌核糖体基因的系统发育分析,表明菌株LNSW1与GenBank中尖孢炭疽菌菌株AB729126、KF698729、EU886755聚在同一分支,B-Cg1与胶孢炭疽菌菌株JF923828、KF516931、GU174547聚在同一分支,相似度分别为99%-100%;两对炭疽菌特异性引物扩增结果再次证明所获代表菌株分别为尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌; 致病性测定结果表明,尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌菌丝块接种8个蓝莓品种的叶片及枝条均可致病,两类病菌回接症状与田间自然发病症状较为相似,尖孢炭疽菌对蓝莓的致病稍强于胶孢炭疽菌。【结论】通过对辽宁省蓝莓主产区的蓝莓发病枝条及叶片的病原菌进行形态学和分子学鉴定,基本明确辽宁省部分地区的蓝莓炭疽病是由尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌侵染所致。     

宁夏苦豆子中产苦参碱内生真菌的分离与鉴定

【目的】从宁夏野生苦豆子中分离内生真菌,筛选能够产生苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱或槐定碱4种喹诺里西啶类生物碱的内生真菌。【方法】应用光学显微镜和扫描电子显微镜对分离菌株显微形态进行观察,根据形态对各菌株进行初步分类;应用薄层色谱法、气相色谱-质谱联用法和酸性染料比色法检测各分离菌株的生物碱成分。对能够产生生物碱的真菌ITS和SSU rDNA序列进行扩增和测序,根据序列信息进行同源性比较和系统发育树构建;结合形态特征,对其进行种属分类。【结果】从苦豆子中共分离到27株真菌,其中23株分属于青霉属、曲霉属、链格孢属、镰刀菌属、Simplicillium属真菌,4株为不产孢菌;筛选出E1、E3和E5这3株能够产生苦参碱的内生真菌,均属于Simplicillium属真菌,其菌丝中苦参碱的含量分别为20.4、17.4和37.6 μg•g-1。【结论】根据真菌形态特征、同源性比较和遗传进化分析结果,确定该3株产苦参碱内生真菌均为Simplicillium lanosoniveum。     

水稻胡麻叶斑病病原菌的分离及鉴定

【目的】对水稻胡麻叶斑病病原菌进行分离和鉴定,为进一步研究该病的发病机理和有效防控奠定基础。【方法】采用常规真菌分离方法分离水稻胡麻叶斑病病原菌,通过回接试验进行柯赫氏法则验证,对确认为水稻胡麻叶斑病病原菌的菌落进行形态学和分子鉴定。【结果】经回接试验确认分离的水稻胡麻叶斑病病原菌的分生孢子梗单生,褐色,不分枝,顶端呈膝状弯曲,分生孢子呈长椭圆形、梭形、倒棍棒状,正直或向一侧弯曲,褐色,两端渐狭,钝圆,种脐较平,有5～10个假隔膜。18S rDNA和ITS序列长度分别约为1.8 kb和570 bp,与待鉴定病原菌18S rDNA同源性最高的是狗牙根平脐蠕孢有性态（Cochliobolus cynodontis）,二者的相似度为99%;与其ITS序列同源性最高的是稻平脐蠕孢（Bipolaris oryzae）,二者的相似度也为99%。聚类分析发现,该病原菌与蟋蟀草平脐蠕孢（Bipolaris eleusines）的18S rDNA同源关系最近,与平脐蠕孢属（Bipolaris sp.）的ITS同源关系最近。【结论】成功分离到水稻胡麻叶斑病病原菌,形态学与分子鉴定结果均显示其为稻平脐蠕孢。     

宁夏白芨滩自然保护区苦豆子内生真菌的区系组成及其抑菌活性

【目的】探索宁夏干旱荒漠区苦豆子内生真菌的区系组成及特点,为苦豆子内生真菌的合理开发和利用提供理论依据。【方法】从宁夏白芨滩国家级自然保护区植被、土壤类型等不同的5个样区采集苦豆子样品25份,分离苦豆子内生真菌,并根据培养性状、菌落、孢子等形态特征对其进行鉴定;根据苦豆子的侵入率、分离率、物种多样性指数和相似性系数,分析其区系组成特点;采用琼脂移块法,检测所分离的内生真菌对番茄早疫病菌（Alternaria solani）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、马铃薯干腐病菌（Fusarium sulphureum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）等6株植物病原菌的的抑菌活性。【结果】从25份苦豆子样品中,共分离到214株内生真菌。同一植株不同组织中的内生真菌数量以种子最多,叶部最少;植被类型中,沙生植被草原比荒漠草原分离的苦豆子内生真菌多。经鉴定,从各样区分离的苦豆子内生真菌分属22个属,其中卵形孢霉属（Oospora）和头孢霉属（Cephalosporium）为样区共有属。样区Ⅰ与样区Ⅲ及样区Ⅳ与样区Ⅴ的内生真菌群落有密切的亲缘关系,相似性较高。214株内生真菌中有167株（78.0%）有抑菌活性,不同属内生真菌的抑菌率差异较大。【结论】宁夏干旱荒漠区苦豆子内生真菌具有丰富的多样性和较高的抑菌生物活性。     

哈密淖毛湖主栽甜瓜病原微生物分离及鉴定

【目的】研究新疆哈密淖毛湖主栽甜瓜品种黄86及西州蜜的健康和发病植株根、藤蔓、果实及根际土中可培养微生物的分离、培养及鉴定,为淖毛湖主栽品种的甜瓜病害防控提供必要的病原菌和微生物病害种类信息。【方法】采集病株及对照健康株样品的根、藤蔓、果实及根际土,采用稀释涂布法分离、培养细菌及真菌,采用16s rDNA及ITS 初步鉴定分离菌株,对比健康株及病株样品中的微生物,分析潜在的病原菌及微生物病害种类。【结果】甜瓜品种黄86健康株及病株中共计分离、培养鉴定可培养菌株23株,其中细菌13株,真菌10株,潜在病原菌4株;甜瓜品种西州蜜健康株及病株中共计分离、培养鉴定可培养菌株51株,其中细菌37株,真菌14株,潜在病原菌4株。【结论】甜瓜品种黄86主要病原菌2株,为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)可分别引起甜瓜枯萎病、黄萎病;甜瓜品种西州蜜主要病原菌1株,为腐皮镰孢菌(Fusarium solani),可引起甜瓜镰孢根腐病。     

解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抑制作用

【目的】从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）生防菌株B1619发酵液上清中分离脂肽类抗生素,分析其抑菌活性相关成分,为应用解淀粉芽孢杆菌B1619菌株防控番茄枯萎病提供依据。【方法】利用特异性引物对B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因sfp、ituA和fenB进行检测;通过盐酸沉淀、甲醇抽提法等方法提取脂肽类抗生素粗提物;用Supelclean^TM LC-18柱及PHASE HF-NH2柱对3种脂肽类抗生素粗提物进行分离;通过MALDI-TOF-MS和HPLC分析、鉴定3种脂肽类抗生素;采用平板对峙培养分别测定3种脂肽类抗生素粗提物对番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的抑菌活性。【结果】从解淀粉芽孢杆菌B1619的基因组DNA中扩增sfp、ituA和fenB等脂肽类抗生素合成基因,扩增产物经克隆、测序分析,表明B1619菌株中含有这3个基因。通过HPLC分析,发现60%甲醇洗脱液分离物分别在12、16.5、18 min处出现相应峰值,保留时间与bacillomycin L标准品一致,分泌量为18.5 mg·L^-1;70%甲醇洗脱液分离物分别在22、34、37、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与fengycins标准品一致,分泌量为5.1 mg·L^-1;100%甲醇洗脱液分离物分别在27、37、41、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与surfactins标准品一致,分泌量为74.3 mg·L^-1。经液质联用进一步验证分析3种脂肽类抗生素的质子化峰值,60%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 043.4、1 057.5和1 071.4 Da,是C13-C15的bacillomycin L;70%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z= 1 463.9、1 477.9、1 491.9和1 505.9 Da,是C15-C17的fengycins;100%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 008.6、1 022.7和1 036.7 Da,是C13-C15的surfactins。平板对峙法试验结果表明1 mg·mL^-1 bacillomycin L和fengycins对番茄枯萎病菌有较强的抑菌效果,而1 mg·mL^-1surfactins对番茄枯萎病菌的抑菌活性较弱,再将surfactins的浓度提高至3和6 mg·mL^-1,发现其抑菌效果没有明显变化。【结论】B1619菌株分泌3种脂肽类抗生素,其中对番茄枯萎病菌生长起重要抑制作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins,surfactins对番茄枯萎病菌的抑制活性较弱。     

一种侵染红枣叶片和果实的病原真菌鉴定

【目的】研究新疆地区近年发生的一种与枣花叶病有密切关系的病原真菌。【方法】通过病样采集、病原菌分离、回接证病,以及形态观察和rDNA-ITS序列比对等方法,鉴定病原菌。【结果】从有明显花叶症状和褐色叶斑的病叶以及有畸果症状和褐色斑点的病果中分离获得多个真菌单孢菌株,用针刺法将其接种到枣叶和幼果后出现与田间症状基本相似的褐色坏死斑,确定其对枣叶、果的致病性;该菌病原菌形态特征与头状茎点霉基本一致,3个分离菌株的rDNA-ITS序列与头状茎点霉的同源性达到99%。【结论】根据病原菌的形态特征和分子鉴定结果,将该病原菌鉴定为头状茎点霉(Peyronellaea. glomerata)。