基于PK15细胞的猪圆环病毒2型全悬浮培养工艺

【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺（病毒种毒来源、MOI及收获时间）,为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×10⁶细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒（来源于贴壁细胞或悬浮细胞）,摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收获时间（48、72、96、120h）,确定PCV2最佳生产工艺。【结果】（1）贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×10⁶/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×10⁶/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;（2）3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到10^6.4TCID₅₀/mL,克隆PK15-2F11（10^5.5TCID₅₀/mL）、PK15-1E5（10^5.6TCID₅₀/mL）,3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆（10^4.7TCID₅₀/mL）,但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;（3）使用贴壁细胞来源的种毒（10^6.4TCID₅₀/mL）感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为10^6.5TCID₅₀/mL。以来源于悬浮细胞的种毒（10^6.3TCID₅₀/mL）感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达10^7.3TCID₅₀/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达10^7.3TCID₅₀/mL,可用于工厂化疫苗生产。     

猪圆环病毒2型基因1群B亚簇的体外培养特征

为探寻猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中的复制特征,将PCV2基因1群B亚簇(PCV2–1B)病毒感染PK15均质细胞A10,待感染细胞层长满,对其进行连续传代;对第5、6代细胞进行维持培养,即在细胞长满后隔天更换培养基,以维持细胞良好的生长;用第10代带毒细胞的培养液接种A10细胞,并进行换液维持培养。PCR与定量PCR检测结果表明,PCV2–1B病毒感染A10细胞后,其病毒基因组的含量在感染细胞长满之前(约96 h)随着细胞的增多而上升,同时也随着传代次数的增多而上升;换液维持培养的细胞,在维持10 d后PCV2–1B病毒基因组的含量能维持在107~108拷贝/mL,而第10代带毒细胞的培养液接毒A10之后,病毒基因组含量随细胞增多而上升,在达到约108拷贝/mL后,病毒基因组含量维持在107~108拷贝/mL。     

猪圆环病毒2型培养方法的研究

利用有限稀释法从含猪圆环病毒2型(PCV2)的PK15细胞中克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15-A8细胞株,初步研究了该克隆株中PCV2增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光试验结果表明,将该克隆株在方瓶中静置培养连续传代40代后病毒滴度最高可达10~(7.5)TCID_(50)/mL,用生物反应器培养病毒滴度最高可达10~(8.0)TCID_(50)/mL以上。利用常规方瓶培养细胞方法,在37℃培养96h,收获得到猪圆环病毒2型病毒液。本研究结果为进一步开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型组织培养特性研究

将经鉴定为PCV2阳性无菌处理的组织样品匀浆液接种到无PCV污染的PK15细胞中传代,PCV2病毒组织培养特性是添加D-氨基葡萄糖可有效地促进PCV2病毒的增殖复制,但病毒致细胞不产生病变,不能直接观察。应用PCR方法检测组织细胞培养物中的病毒增殖和增殖滴度,测定了PCV2病毒收获时间,试验表明PCV2病毒在PK15组织培养可连续传代,增殖病毒。     

用微载体系统培养PK15细胞生产猪圆环病毒2型

研究了生物反应器、转瓶、方瓶3种不同培养系统生产PCV2,对转瓶不同参数下的病毒效价情况进行了比较和优化,最终确定培养参数为:以1∶10稀释种毒后接种、接种24 h的PK15细胞、5～7 mg/mL微载体浓度和维持液低糖DMEM+2 g/L水解乳蛋白(LH)的培养方式效果最为理想;采用微载体和反应器系统生产PCV2,病毒效价可达105.0 TCID50/mL以上.     

疑似PMWS患猪中PCV2的分离及全基因组序列分析

将疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病猪肺脏研磨、过滤除菌后接种无PCV1污染的PK15细胞,盲传4代,用PCR和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)检测。同时,利用所合成的PCV2全长的特异性引物进行病毒基因组全长的扩增及克隆、测序与比对分析。结果显示,不同传代细胞中PCV2核酸均为阳性,且PCV1特异引物检测为阴性,表明分离到的PCV2无PCV1污染,将该毒株命名为PCV2 B1株。序列分析表明,该病毒基因组全长1767 bp,与其他毒株的核苷酸同源性在95.4%~99.8%之间,ORF1的氨基酸的同源性在98.4%~99.7%之间,ORF2的氨基酸的同源性在89.7%~100%,核苷酸和氨基酸的序列与保定株BD1A(DQ910865)的序列最接近。     

一株猪圆环病毒2型的分离与分子鉴定

利用PCR技术初步检测疑似PCV2感染的猪肺脏和淋巴结中的病毒.将样品处理后接种于PK-15细胞.从感染PK-15细胞PCR扩增PCV2基因片段,克隆入pMD18-T载体,并进行序列测定和比较.序列分析结果表明,分离病毒的PCR产物与国内多株PCV2核酸同源性大于98%,说明所分离的病毒为PCV2.     

嵌合猪圆环病毒的构建

[目的]为了构建猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的嵌合病毒,并为PCV2疫苗研究奠定基础.[方法]以PCV1基因组为骨架,将其衣壳基因替换为PCV2衣壳基因,来构建嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)DNA克隆,将PCV1-2 DNA克隆转染PK-15细胞以获得拯救病毒PCV1-2,并测定PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性.[结果]酶切和序列测定显示成功构建出PCV1-2 DNA克隆;免疫荧光试验和PCR检测显示成功获得拯救病毒PCV1-2,其效价达到1060 TCIDs0/mL以上;一步生长曲线显示PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性与其亲本病毒近似.[结论]成功构建了1种具有较高体外增殖能力的嵌合猪圆环病毒.     

猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对 PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过 PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株 PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在 PK15细胞上增殖,特异性 PCR检测可扩增出特异性片段,经 PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其 TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%～96.8%;与 AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ 和AF055392属于基因型 PCV2a,与 PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区 PCVAD的防控提供了理论依据。     

不同接毒方法培养鸡痘细胞苗维持液与细胞内病毒含量的测定

以同步接毒和异步接毒培养鸡痘细胞苗,在其他条件相同前提下,发现同步接毒维持液的pH变化、细胞病变与异步接毒存在一定差异。为明确两种接毒法对病毒增殖效果的影响,本试验分别对维持液和病变细胞的毒价进行了监测。经过试验测得同步接毒法的细胞内含毒量明显高于异步接毒法。     

后海穴免疫与常规免疫奶牛乳腺炎三联灭活苗的效力比较

以荷斯坦奶牛为试验动物,分别在后海穴、臀肌和皮下接种乳腺炎灭活疫苗,比较其免疫效力,结果显示后海穴免疫首先能节省疫苗用量,同时还可以提前产生免疫力,显著提高血清中的抗体水平（P〈0．01）;其次,接种疫苗时因针刺穴位的作用,显著提高了血液中的白细胞总数和淋巴细胞数。增强了免疫细胞的功能;最后显著降低乳汁中的体细胞数（P〈0．01）。     

水稻白叶枯病剪叶接种和喷雾接种方法的比较

[目的]为鉴定水稻品种对白叶枯病的抗性提供理论依据。[方法]以152个水稻品种为试材,分别采用剪叶接种法和喷雾接种法对其接种水稻白叶枯病菌,研究接种方法对水稻抗病性鉴定的影响。[结果]除高感品种外,喷雾接种水稻的发病情况轻于剪叶接种;喷雾接种一次可达到多个品种抗性鉴定的目的,接种到调查约30d的时间足以使病菌进行多次侵染,但该接种方法成败的关键在于喷雾后立即捆扎稻丛3d。[结论]喷雾接种法可满足水稻品种抗性鉴定的技术要求,并大大降低鉴定的工作量。     

利用桑木人工栽培药用真菌灵芝(Phellinus linteus)的研究

比较了利用无菌短木接种法、钻孔接种法和端木夹心接种法等接种方法接种桑树段木后Phellinus linteus的菌丝生长和定殖状况.研究表明利用灭菌的短木接种P.linteus,生长和定殖良好,传统的钻孔接种法和端木夹心接种法菌丝生长定殖不好.P.linteus在20 cm长的桑木上生长和定殖所需的最适的含水量为42%,接种后12 h,P.linteus立即进入快速生长期.接种后的桑木埋入土壤中需要5～6个月产生担子果,在培养室内温度为31～35℃,相对湿度大于96%时有利于子实体的形成.     

不同接种方式下番茄溃疡病病原菌的致病效果比较

番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是目前国内外番茄生产上最严重的细菌病害之一。为建立准确有效的人工接种鉴定体系,本研究采用5种不同的人工接种方式(剪顶法、喷雾法、复叶柄注射法、茎顶端注射法和茎基部注射法)对番茄植株进行接种,比较和分析了接种后各群体植株起始发病时间、平均发病率、病情指数和平均死株率等指标。结果表明:剪顶法和茎部注射法接种病原菌致病效果最好,发病率达到100.0%,病情指数>75.0,但是剪顶法接种后植株死亡率很高,接种40 d时死亡率高达96.7%,不利于后续的遗传分析及留种;进一步分析发现茎基部注射接种时病原菌在植株体内传播速度更快;用5份抗感性不同的番茄材料及2个遗传分离群体共计742株番茄进行茎基部注射接种,结果表明该法接种后可以准确区分番茄材料的抗感性。综上所述,本研究结果表明茎基部注射法接种适用于番茄材料抗溃疡病评价及遗传分析,为抗溃疡病番茄材料的筛选及抗性品种的培育提供了有力支撑。     

粟酒裂殖酵母接种方式对黑比诺干红葡萄酒品质的影响

为了提高黑比诺干红葡萄酒的品质,本试验选用黑比诺葡萄为原料,采用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe,S. pombe)单一菌株接种发酵及与商业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S. cerevisiae)同时或顺序接种进行酒精发酵,并以S. cerevisiae单独接种完成酒精发酵后进行苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒为对照,监测其发酵过程中苹果酸、生物胺等理化指标的变化,采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)分析挥发性香气物质的变化,并进行感官评价。结果表明:S. pombe单独接种及与S. cerevisiae同时或顺序接种发酵的残糖、酒精度、总酸和挥发酸均符合国标GB 15037—2006《葡萄酒》对干红葡萄酒的要求;S. pombe单独接种及与S. cerevisiae同时或顺序接种发酵都能够完成酒精发酵;与对照相比,处理组的接种方式均能够显著降低葡萄酒中苹果酸和组胺的含量,其中,S. pombe和S. cerevisiae顺序接种发酵的葡萄酒中苹果酸和组胺含量明显低于S. pombe单独接种及与S. cerevisiae同时接种发酵。S. pombe和S. cerevisiae顺序接种发酵能够明显丰富葡萄酒中的醇类、酯类和萜烯类物质,使葡萄酒中具有浓郁的果香和花香。感官分析发现,S. pombe和S. cerevisiae顺序接种发酵的葡萄酒感官品质较优于其他处理组。综上所述,在S. pombe的不同接种方式中,S. pombe和S. cerevisiae顺序接种能够更好地增加黑比诺干红葡萄酒的醇类、酯类和萜烯类物质含量及种类,降低苹果酸含量,能够提升葡萄酒感官品质。     

氮营养对菜心炭疽病抗性生理的影响Ⅰ.氮营养对菜心炭疽病及细胞保护酶的影响

研究了6种不同氮营养水平下炭疽病菌对菜心叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性的影响及其与抗病性的关系.结果表明,适宜的氮营养处理(N3处理)可提高植株的耐病能力,病情指数降低.氮营养对植株细胞保护酶系统有明显的影响,炭疽病菌对SOD、POD、CAT活性有明显的诱导调节作用.接种后,适宜氮营养比高氮、低氮或不施肥可加强炭疽病菌对POD活性的诱导和抑制炭疽病菌在前期对SOD活性的诱导,但在后期则加强了对SOD活性的诱导.不同氮营养下炭疽病菌对CAT的诱导调控作用不同,不施肥或较高的氮营养在致病过程中都显著地提高CAT活性,但适宜氮营养下只是前期具有明显的促进作用,后期逐渐转化为抑制作用.     

油菜蕾薹期和花期菌核病接种方法比较

核盘菌引起的菌核病是油菜重要病害。为建立快速有效的油菜菌核病抗性鉴定方法,在油菜花期采用4种人工接种方法测定了5种油菜资源对菌核病的抗病性,并分析采用不用接种方法测定的病斑大小之间的相关性。这4种方法分别为:离体叶片接种、离体茎段接种(牙签法)、活体茎秆接种(牙签法)、活体叶柄接种(吸头法)。这4种接种方法中,离体叶片接种法与其余3种方法的鉴定结果均没有显著相关性;采用叶柄接种法,接种后11 d和19 d的病斑长度与离体茎段接种3 d和7 d的病斑长度之间的相关性显著(P0.05),相关系数分别为0.866和0.821,与活体茎秆接种7 d和15 d的病斑长度极显著相关(P0.01),相关系数分别为0.952和0.987。结果表明移液管介导的叶柄接种是一种便捷、可靠的油菜菌核病抗性鉴定方法。     

稻瘟病诱导抗性研究初报

 首先鉴定单孢分离菌株20-6,20-7,20-21,20-3,分别为稻瘟病菌生理小种ZB₂₅,ZC₉,ZD₁,ZA₅₇． 然后又分别由相应发病鉴别品种叶上再分离以获得ZB₂₅,ZC₉,ZD₁,ZA₅₇4个小种,根据各个小种对我国一套稻瘟病菌生理小种鉴别品种的反应型,其对一定的品种为致病菌,而对另外的品种则为非致病菌。先用非致病菌作“诱发接种”（inducing inoculation）,然后再以致病菌作“挑战接种”（challenge inoculation）,结果表明,稻株可产生不同程度的诱导抗性。     

南瓜病毒病接种条件和抗性生理生化指标的研究

通过单因素试验,研究了接种浓度、温度、苗龄对南瓜病毒病接种效果的影响,筛选出南瓜苗期最佳抗性鉴定方法,即植株在子叶期或1片真叶期,25℃,稀释2倍时接种最好,用此法对55份试验材料进行抗性鉴定,筛选出抗性材料5份,17份中抗材料。用一份中抗材料南瓜苗期接种西瓜花叶病毒2号(WMV-2),分析电导率、多酚氧化酶(PP0)、叶绿素含量的变化。结果表明,接种后电导率、PPO活性均是接种植株高于健康植株,而叶绿素含量是接种植株低于健康植株。     

茄子黄萎病(Verticillium dahliae)人工免疫研究初报

试验证明分别用瓜类炭疽刺盘孢菌(Colletotrichum Lagenarium),大丽菊轮枝菌(Veriticillium dahliae),枸杞炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium Oxysporium f·sp,cucumertum)在茄苗第二片真叶上诱发接种后,不经强化接种没有明显的免疫效果。用大丽菊轮枝菌和尖孢镰刀菌黄瓜专化型在第三片真叶上诱发接种(V_3,F_3),再在第4片真叶上强化接种一次,有明显的免疫效果,免疫效果均为71.4％。用瓜类刺盘孢菌,枸杞炭疽病菌和尖孢镰刀菌黄瓜专化型在第2片真叶上诱发接种(C_2,G_2,F_2),再在第3片真叶上强化接种一次有较好的免疫效果,免疫效果分别为66.7％,60％,58.3％。用尖孢镰刀菌黄瓜专化型蘸根诱发接种的处理(Fr)免疫效果为60.8％。