郁金香种球传带南芥菜花叶病毒的检测

对从荷兰进口的郁金香种球进行检疫，应用培育长出的叶片作为检测材料，采用双抗夹心酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）和RNA逆转录PCR扩增法（RT-RCR）进行南芥菜花叶病毒的检测。从这些种球上发现了我国进境植物检疫二类危险性有害生物一南芥菜花叶病毒。     

南芥菜花叶病毒分子生物学快速检测方法的研究

根据南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic Nepovirus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR检测引物,对南芥菜花叶病毒和非南芥菜花叶病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应。结果,南芥菜花叶病毒的感病植物组织的PCR产物均出现364bp的特异性扩增条带,而非南芥菜花叶病毒均未出现扩增条带,证明这对引物具有南芥菜花叶病毒鉴定特异性。将提取的南芥菜花叶病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系最低可检出南芥菜花叶病毒提取的RNA模板浓度为150pg/μL。     

花卉病毒病害的鉴定-(Ⅱ)

 本文对7种花卉病毒进行了寄主范围,症状反应、蚜虫传播、血清学、交互保护反应等试验以及电镜观察,结果表明,引起秋海棠叶片退绿环斑及坏死环斑、绣球暗绿花叶、绣球叶片皱缩及叶片簇生、凤仙花系统退绿及矮化、唐菖蒲条纹花叶、百合严重失绿及顶尖坏死、月季叶片扭曲皱缩及脉失绿、月季叶片呈现蚀纹及波纹状黄色花叶和虞美人叶片失绿及幼苗萎蔫的毒原依次为李坏死环斑病毒、烟草环斑病毒(TRSV)、绣球环斑病毒、TRSV、黄瓜花叶病毒、TRSV、南芥菜花叶病毒、苹果花叶病毒以及TRSV。     

检验出国家一类病毒云南及时销毁进口花种

记者12月5日从云南检验检疫局获悉，云南检验检疫局日前集中销毁4批、8个品种带有番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的进口百合花种球，确保了云南花卉的产业安全。据了解，由昆明星光卉欣园艺有限公司、昆明芊卉种苗有限公司和云南工艺品进出口有限公司分别从荷兰、新西兰、智利进口的价值15万元人民币的百合花种球，     

多重RT-PCR方法检测3种检疫性病毒的研究

根据番茄环斑病毒(ToRSV)、南芥菜花叶病毒(ArMV)和草莓潜隐环斑病毒(SLRSV)3种检疫性病毒的外壳蛋白基因保守序列设计特异性引物,在建立各种病毒单个RT-PCR技术的基础上,通过优化多重RT-PCR反应条件,初步建立了同步检测这3种病毒的多重RT-PCR检测体系。结果表明:3对引物特异性较强,分别可以扩增出580、438、298bp的目的片断;该方法快速、灵敏、准确,为同时检测进境百合中多种病毒提供了参考。     

青海地区唐菖蒲生长及球茎贮藏期间病害发生现状研究

唐菖蒲(Gladiolus hybridus)在生长过程中,易受不良环境的影响及真菌感染产生多种病害,如叶片锈病、根腐、球茎腐烂病等真菌性病害及病毒病害,这些真菌性病害和病毒病害都严重影响唐菖蒲植株的生长势及鲜切花的观赏价值。本研究于2013-2014年对青海省唐菖蒲主产区田间及球茎贮藏期间的病害发生进行了调查,以确定发病种类、危害程度,并进行田间取样,在室内分离培养,通过显微镜观察鉴定和回接实验,研究病原菌种类及致病性。研究结果发现:唐菖蒲生长期间有3种真菌性病害(球茎腐烂病、根腐病和锈病)和1种病毒病(烟草花叶病),而贮藏期间球茎发生球茎腐烂症状。田间发病最严重的是真菌性病害,发病率为7.8%~66.7%(重茬地块发病率最高)。真菌性病害中尤其是球茎腐烂病和根腐病受地区气候影响最大,夏季高温和平均温度较高的地区发病率越重,因此,作为种球繁殖基地,夏季气候冷凉是减轻发病率的关键。田间病原菌分离后经荧光显微鉴定证实尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)是唐菖蒲根腐病的致病病原;青霉菌(Peniaillum sp.)为青霉属真菌,但回接后无致病性;单胞锈菌(Uromyces sp.)为唐菖蒲叶片锈病的致病病原。不同贮藏方式及贮藏温度下的发病种类和发病率存在较大差异,从贮藏期间腐烂的球茎上我们分离到3种病原真菌,经显微鉴定和回接实验证实为无致病性的次生真菌和球茎腐烂病致病病原。采用r DNA-ITS分子标记对贮藏期间病原菌8个样进行鉴定,通过DNA提取、通用引物扩增r DNA基因族ITS全序列、PCR产物的回收纯化及序列分析,对测定序列blast比对表明:Gp6的r DNA-ITS序列与Talaromyces funiculosus菌株的ITS序列同源性高达99.75%,确定为青霉属、篮状菌亚属中的Talaromyces funiculosus。2013、2014年通过生长期间叶片、花瓣的表现特征,对田间疑似携带病毒的植株,分别选用黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus,TRSV)三种病毒ELISA试剂盒进行双抗体夹心酶联免疫检测。对24组样品进行检测,空白对照及标样阴阳性检测证明试剂盒酶标板灵敏有效,其中,黄瓜花叶病毒、烟草环斑病毒的样品OD值均小于临界值(CUT OFF),判定为阴性,即样品中未检测到黄瓜花叶病毒、烟草环斑病毒。在烟草花叶病毒检测中,样品05、07的OD值大于临界值(CUT OFF),判定为阳性,即样品05、07中含有烟草花叶病毒。根据取样量和检测量比较,烟草花叶病毒的检出率达到8%左右。     

唐菖蒲种球贮藏技术

唐菖蒲是世界上五种鲜切花其中的一种,在市场中受到了人们的广泛欢迎,需要进行常年的供应,因此,在一年当中需要分批次进行唐菖蒲的种植,这就要求种子供应商在每年的不同季节都能提供种球的供应。在实际的贮藏过程当中,一般两个月之后,唐菖蒲种球就会发生腐烂的现象。一般在5个月之类,会有50%的种球发生腐烂,同时健球的概率也较为低下。为了应对此种情况,对唐菖蒲种球的存储技术进行了相关的研究,使得唐菖蒲在贮藏半年之后的腐败率被控制在1.0%~1.5%左右,从而使得唐菖蒲的种球在全年都能实现贮藏,为种球的供应提供了良好的条件     

马铃薯地套种唐菖蒲种球

近几年来，云南的唐菖蒲花卉种球基本上都是从国外，或是国内的北方引进，种球的质量得不到保证，而从国外引进的种球价格太高，花农几乎没有效益。而云南种植唐菖蒲所需要的种球量很大，为了有我们云南自己繁殖的好唐菖蒲种球，我们在东川3000m海拔的高寒山区进行了唐菖蒲种球繁殖。其繁殖方法     

华南地区唐菖蒲籽球规格对其商品种球繁育的影响

唐菖蒲(Gladiolus hybridus Hort.)的商品种球通过籽球培育途径生产.为探讨籽球大小对商品种球繁育的影响,采用3个不同规格的籽球进行繁种试验.结果表明,以周径2.1～3.0 cm的籽球繁育商品球效果较好,达到商品种球规格(周径＞6 cm)的种球占所收种球的50％以上,折合每667 m2可生产15 0...     

唐菖蒲高效栽培技术研究

采用日光温室反季节繁育唐菖蒲种球,从而为第2年秋季温室切花生产提供优质唐菖蒲种球.同常规繁育方法相比,该方法减少了贮藏过程中种球的养分消耗,降低了种球的腐烂率,提高了唐菖蒲切花品质和花农经济效益.     

胶体金免疫层析试纸结合RT-PCR法快速检测烟草环斑病毒

利用烟草环斑病毒胶体金免疫层析检测试纸条,对烟草环斑病毒3个分离物进行了快速检测。结果表明,试纸条在10min内,可特异性检出烟草环斑病毒的3个分离物,对番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄黑环病毒和健康叶片无反应。剪下试纸条上显示的检测带,进行RT—PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带。试纸条检测烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg·mL^-1,试纸条检测烟草环斑病毒的病汁液,检测灵敏度在10^-3（W／V）,试纸条检测灵敏度与DAS—ELISA方法灵敏度基本相同。     

延庆地区侵染百合的病毒检测与序列分析

利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法,对北京市延庆地区疑似感染病毒的百合植株进行了检测,并将RT-PCR扩增到的产物进行克隆及序列分析验证。DAS-ELISA结果表明：百合叶片的粗汁液与TuBV的抗体呈现阳性,初步确定北京市延庆地区百合感染郁金香杂色病毒（TuBV）。RT-PCR检测结合克隆测序结果表明：郁金香碎色病毒CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的（AB090385.1,AB078007.1和S44147.1）郁金香碎色病毒的核苷酸序列的同源性均为100%,与已登录的（qb｜AAB19407.1｜,dbj｜BAD02938.1｜和dbj｜BAB83899.1｜）氨基酸序列同源性均在95%以上,同源性较高,进一步证明北京市延庆地区百合感染有郁金香杂色病毒（TuBV）。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白抗原表位分析及其快速ELISA检测方法的建立

【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL^-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL^-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVY^N及PVY^O样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。     

引进种质西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测

从日本引进的西瓜种子隔离种植后,采用生物学、双抗体夹心酶联方法及反转录PCR(RT-PCR)技术对其幼苗样品进行了黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的检测,结果表明:生物学试验接种的黄瓜健康植株全部发病;双抗体夹心酶联试验结果均为阳性;RT-PCR反应后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果出现预期的715 bp特异性扩增产物。3种方法均表明此次从日本引进的西瓜种质已经受到黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染,须做销毁处理。试验结果表明,采用3种方法中的2种对样品进行检测,即可以根据检测结果确诊被检对象是否带有CGMMV病毒。     

百合无症病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

 应用DAS-ELISA,RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测百合无症病毒（LSV）。 结果表明:RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2 ng和200 ng百合叶片组织中检测出LSV,分别是DAS-ELISA敏感度的1 000倍和10倍。百合鳞茎的不同取样部位对PCR检测结果的影响较大,RT-PCR难以从鳞片和根部检测出病毒,但IC-RT-PCR可以检测出病毒。     

利用DAS-ELISA检测侵染观赏百合黄瓜花叶病毒的研究

从制备的黄瓜花叶病毒———观赏百合分离物(CMV-Li)抗血清中提纯了IgG,并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立了检测CMV-Li的DAS-ELISA(double antibody sandwich-enzyme-linked immumnosor-bent assay)系统,利用此检测系统并结合生物学方法,对临洮切花百合田间病样和百合不同部位带毒量进行了检测,结果发现CMV-Li的侵染率为23.81%,叶片的带毒量明显高于花和鳞茎.     

海南省香草兰上病毒病的病原检测

采用双抗体夹心酶联(DAS-ELISA)检测法和反转录PCR(RT-RCR)扩增法对海南省送检的香草兰叶片样品进行病毒病的病原检测,结果在香草兰叶片样品上发现了建兰花叶病毒。     

北京、宁夏甜椒上分离的黄瓜花叶病毒CP基因序列分析及亚组鉴定

从宁夏和北京地区甜椒上分离到3个黄瓜花叶病毒分离物(宁夏分离物为CMV-NX1,NX2;北京分离物为CMV-BJ)并保存在普通烟上。从叶片中提取该病毒RNA,经RT-PCR扩增到780bp的全长CP基因的cDNA,PCR产物纯化并测序。2个宁夏分离物(NX1,NX2)核甘酸序列同源性为100%,它们为同一株系。与已报道的部分CMV株系的CP基因序列相比较,表明3个分离物与CMV亚组I同源关系比亚组II更密切,因而3个分离物都属于黄瓜花叶病毒亚组I,通过DAS-ELISA进一步验证它们都属于亚组I。     

TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒血清学检测方法研究

采用摩擦接种和PEG沉淀法对侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV)进行了提纯,提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线,D260 nm/D280 nm=1.236;利用提纯的CMV免疫大白兔制备抗血清,经微量沉淀法测定,其效价为1∶1024;用硫酸铵沉淀法提纯IgG,制备了辣根过氧化物酶标抗体,利用自制抗血清对DAS-ELISA、间接-ELISA和DIBA-ELISA检测侵染观赏百合的CMV灵敏度和检测范围进行了比较试验,结果表明DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是间接-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4倍;间接-ELISA和DIBA-ELISA的检测范围比DSA-ELISA宽.对21个观赏百合样品的CMV检测结果表明,DIBA-ELISA的检出率为66.67%,间接-ELISA的检出率为38.09%,二者的检出率分别比DAS-ELISA的检出率(23.81%)提高了42.86%和14.28%.