H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及序列分析

应用RT-PCR方法,以1株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NA全基因cDNA。将NA cDNA克隆于pMD18-T栽体,并对其进行了测序。测序结果表明：所克隆的NA基因全长为1416bp,编码区为1410个核苷酸,编码469个氨基酸。将其序列与5株H5N1亚型禽流感病毒NA基因序列进行比较,其核苷酸和氨基酸同源性均为96.6％～99．1％。NA的克隆和分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。     

湖南洞庭湖区12株H9N2亚型AIV全基因序列的进化分析

【目的】从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律。【方法】对近年来洞庭湖区分离的12株H9N2亚型禽流感毒株的全基因进行分段克隆测序,应用Mega 5软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制与分析。【结果】12株H9N2亚型禽流感毒株HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒。12株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因进化比较同步,均处于DK/HK/Y280/97分支,而6个内部基因(M、PB2、PB1、PA、NA、NS)与高致病性禽流感H5亚型毒株呈现不同程度重组现象,且与H7N9亚型毒株基因的核苷酸同源性很高,很有可能为其提供内部基因。【结论】湖南省洞庭湖地区H9亚型禽流感病毒的遗传演化较为复杂,存在广泛的基因重组现象。     

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为探明贵州H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,为其科学防控提供参考,通过GenBank登载H9N2亚型AIV参考毒株的神经氨酸酶(NA)基因设计引物,进行RT-PCR扩增,然后克隆测序,并进行生物信息学分析.结果表明:H9N2亚型禽流感病毒贵州分离株的NA基因全长为1 414 bp,可编码467个氨基酸,与国内外参考毒株相应序列的核苷酸同源性在87.5％～98.1％;含有6个潜在的糖基化位点;在63～65位缺失T、E和Ⅰ等3个茎部氨基酸,导致第61位糖基化位点丢失;从NA基因系统发育树看,该毒株属于欧亚种系Y280分支.     

贵州H9N2亚型禽流感病毒NA基因的遗传演化特征

为探明贵州H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,为其科学防控提供参考,通过GenBank登载H9N2亚型AIV参考毒株的神经氨酸酶(NA)基因设计引物,进行RT-PCR扩增,然后克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明:H9N2亚型禽流感病毒贵州分离株的NA基因全长为1 414bp,可编码467个氨基酸,与国内外参考毒株相应序列的核苷酸同源性在87.5%~98.1%;含有6个潜在的糖基化位点;在63~65位缺失T、E和I等3个茎部氨基酸,导致第61位糖基化位点丢失;从NA基因系统发育树看,该毒株属于欧亚种系Y280分支。     

江苏H9N2亚型禽流感病毒HA和NA的遗传进化分析

为了解江苏H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,采用RT-PCR技术对10株从江苏不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因进行了扩增、克隆、测序和遗传进化分析。结果显示:10株H9N2病毒间HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.3%~99.0%、93.8%~99.6%,NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.9%~99.9%、95.2%~100.0%,它们均属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群;10株病毒的HA裂解位点均为RSSR-GLF,受体结合位点第198位有8株为苏氨酸,2株为丙氨酸,第191位有1株为组氨酸;10株病毒NA基因在62~64位均存在缺失的现象,从而导致61位的糖基化位点缺失,NA基因第402位均出现了由天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)的变异,8株病毒只具有6个糖基化位点。     

重组H5N1亚型禽流感病毒NA基因腺病毒的滴度测定及遗传稳定性研究

为了研究表达H5N1亚型禽流感病毒NA基因重组腺病毒pAdN1的遗传稳定性及重组病毒的滴度,将重组腺病毒pAdN1在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15、20代的重组病毒,采用PCR 方法扩增禽流感病毒NA基因,并进行基因序列分析;用绿色荧光蛋白做标记计算出20代次时重组病毒的滴度.结果显示:从各代重组病毒DNA 中均扩增出了约1 400 bp的目的条带,序列分析结果表明,第5、10、15代重组病毒中的NA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有2处发生了点突变(516位A→G,1 323位T→C),但其编码的氨基酸未发生变化,即蛋白抗原表位未发生变化;采用快速测定法计算出重组腺病毒的滴度为109.5 pfu/mL.     

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。     

禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4的NP基因序列分析

用RT-PCR法,以1株H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A/Duck/XJ/4为模板,扩增了NP全基因cDNA,克隆至T载体,并进行序列测定.序列分析结果表明:扩增的NP基因全长1518bp,最大的开放阅读框在18～1514bp,编码499个氨基酸.将A/Duck/XJ/4毒株NP基因序列与15株A型流感病毒NP基因序列进行比较,各毒株间NP基因核苷酸序列同源性81.4%～99.0%,编码的氨基酸同源性在92.8%～99.6%.     

鸽源H5N1亚型禽流感病毒NA基因的克隆及序列分析

用TRIAZOL试剂盒提取鸽源禽流感病毒的RNA,应用自行设计的特异性引物对神经氨酸酶(NA)基因进行RT-PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18-T载体上,并进行鉴定和序列测定。结果表明:鸽源H5N1亚型禽流感病毒NA基因全长1 350 bp,编码449个氨基酸。通过序列比较,该毒株与国内同一亚型其他毒株神经氨酸酶的核苷酸同源性为77.6%~98.8%,氨基酸同源性为77.6%~99.1%。     

广西鸭源H3N8亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

[目的]了解广西水禽中分离到的H3N8亚型禽流感病毒的分子遗传进化特征。[方法]将从活禽市场采集的水禽棉拭子样品经处理后接种SPF鸡胚,应用血凝试验和血凝抑制试验对收取尿囊液进行血清学鉴定,然后对分离到的禽流感病毒进行全基因序列测定和遗传进化分析。[结果]血清学及HA和NA基因测序结果显示,该分离毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/duck/Guangxi/446D28/2021(H3N8)。全基因遗传进化分析显示,其HA蛋白无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;NA蛋白出现耐药性氨基酸位点突变;该毒株8个基因片段在GenBank中比对分析结果显示,其同源性最高的毒株基本主要来自越南和位于我国候鸟迁徙路线上的宁夏及江西等省(区)。[结论]该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过相互基因交换所形成的基因重组体。     

H5N1型禽流感模型侵染病毒的构建与鉴定

【目的】构建含有H5N1型禽流感病毒HA、NA的侵染模型病毒,并对构建的模型病毒进行侵染活性及特异性检测。【方法】采用PCR方法扩增出H5N1型AIVHA和NA基因,经纯化回收后将其分别克隆至真核表达载体pcDNA4.0中,构建pcDNA-HA、pcDNA-NA。然后采用磷酸钙共转染方法,将pcDNA-HA、pcDNA-NA和含有LUC报告系统的HIV骨架表达载体pNL4-3.Luc.R-E-,共同转染293T细胞,构建HIV/HA-NA模型病毒,对HIV/HA-NA模型病毒进行细胞侵染活性及特异性检测。【结果】HA、NA基因片段真核表达载体pcDNA-HA、pcDNA-NA与HIV骨架载体在293T细胞中成功表达组装,获得了HIV/HA-NA侵染模型病毒;敏感细胞特异性检测及侵染活性分析表明,HIV/HA-NA模型病毒与其野毒具有共同的敏感细胞。报告系统数据显示,模型病毒可以定量检测其对细胞的侵染程度。【结论】成功构建HIV/HA-NA模型侵染病毒,可以模拟H5N1病毒的侵染过程,定量报告病毒的侵染程度,并且该模型病毒不具有增殖能力,安全可靠,可以方便地用于普通实验室AIV抗体检测和特定药物的筛选。     

禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。     

一株鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006的全基因组序列测定及遗传演化分析

为了解鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006(DK/SH/Y20/06)的来源、特征及其分子演化规律,进一步丰富水禽流感病毒的基因库,对该病毒8个基因片段分别进行了扩增和序列测定,利用分子生物学软件对测序结果进行序列分析,并与GenBank登录的相关病毒进行了遗传演化分析。结果表明,DK/SH/Y20/06的HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于欧亚分支;NA基因与A/mallard/Yanchen/2005(H4N6)在同一分支内,核苷酸序列同源性为98.3%;而PB2、PB1、NP、PA基因与目前在国内流行的H6亚型禽流感病毒关系密切;M基因与A/environment/Korea/CSM05/2004(H3N1)处于同一分支;而NS基因与A/wild duck/Korea/YS44/2004(H1N2)同源性最高。且DK/SH/Y20/06的8个基因与美洲H4N6亚型AIV分离株均不处在同一遗传进化分支上,相互之间遗传关系较远。可见,DK/SH/Y20/06可能是由H4N6、H6N2、H6N5、H3N1和H1N2等不同亚型来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。     

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

巴斯德毕赤酵母多拷贝整合表达组装禽流感病毒样颗粒

【目的】构建多拷贝整合表达禽流感病毒样颗粒的重组巴斯德毕赤酵母,为H5N1亚型禽流感基因工程疫苗提供基础。【方法】以巴斯德毕赤酵母GS115株18S rRNA基因(rDNA)部分序列,插入pPIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K。再以禽流感病毒H5N1毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒 p8K-HA/M/NA。表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞。增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株。阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物。【结果】PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白,免疫印迹试验可检测到与HA、M₁和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80~120 nm 的病毒样颗粒,免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体。【结论】重组毕赤酵母能够多拷贝整合、表达、组装禽流感病毒样颗粒。     

野鸡源H9N2亚型禽流感病毒NA基因的序列分析

通过病毒RNA抽提、RT-PCR、克隆，试验一次性获得野鸡源禽流感病毒A／Pheasant／Guangdong／GZI／2003（H9N2）NA全基因．序列分析及联机检索表明，该病毒的NA基因由1458bp组成，其中开放阅读框（ORF）l401bp编码466个氨基酸；ORF与A／Chicken／Guangdong／11／97同源性最高，达98％；与A／Chicken／Guangdong／11／97的NA亲缘性最近．     

4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律。[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（H9N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株HA基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分别与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株（序列号分别为AF156376,AF156377,AF156378,AF461517,AF461519．AF461521,AF461530,AY364228,AY862606,D90305）进行比较分析,并绘制进化树。[结果]4个毒株HA基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％．其中MY株和ZD株HA基因同源性和氧基酸同源忡均为最高：WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10个毒株的核苷酪和氧基酪序列同源性分别为82．6％-95．1％、83．0％-99．0％、82．7％～95．5％和81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．0％～97．1％、86．9％-97．3％,遗传进化树分析表明,H9N2的HA基因的进化树有2个大的分支,分为2个种系：欧亚种系和北美种系。欧亚种系又分为3个群系,分别以A／Quailf HongKong／G1／97（AF156378）,A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）和A／Duck／HongKong／Y280／97（AF156376）为代表株,将这4个分离株与国内一些参考株、韩国代表株（AY862606）以及上述欧亚种系代表株的HA基因序列进行比较。结果表明,MY株、WD株、PG株和zD株均属于欧亚种系,并且都属于A／Duck／HongKong／Y280／97群系,与国内参考株的亲缘关系都较近,而MY株与A／ChickenfShandong／2／99（AF461521）亲缘关系最近。PG株与A／Chicken／Liaoning／2／00（AF461519）的亲缘关系最近,氨基酸同源性达到97％。ZD株与A／Chicken／Beijing／1／97（AF461530）的亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸的同源性都是最高的,分别达95．7％、97．3％。韩国株（AY862606）则属于A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）群系。总体来看,这4个分离株与国内参考株亲缘关系较近,而与韩国株（AF156377）较远。4个分离株除WD株的HA基因裂解位点为PSRSSR／GLF,MY、PG和ZD株的HA基因裂解位点均为PARSSR／GLF,WD株裂解位点附近的A变为S,也就是由丙氨酸变为丝氨酸,S也是非碱性氨基酸,因此,致病力没有变化,这4个分离株均为低致病性禽流感病毒。HA基因的几个受体位点分别为109aa,161aa,163aa,191aa,198aa,202aa,203aa,通过比较除了PG株的198aa为丙氨酸（Ala）,其他3个都为缬氨酸（Via）。编码198aa的3个碱基由GTG突变为GCG,其他参考株的198aa变异性也较大,A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）和A／Quail／HongKong／G1／97（AF156378）的198aa都是谷氨酸（Glu）,还有的国内株为T。这4个分离株的其他几个受体结合位点的氨基酸都是一样的,然而,通过对10个参考株的比较发现,191aa也容易发生变异,有的变为组氨酸（His）。202aa和203aa在所有的毒株中都比较保守。[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性。但有很多因素能够影响其HA基因的变异,从而影响其致病力,这与地域因素有很大的相关性,因此,应加强地域间的防控。     

4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律：[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（}19N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株删基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分剐与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株进行比较分析,[结果]获得了4个毒株圳基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％;WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10O个毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82．6％～95．1％、83．O％～99．0％、82．7％～95．5％、81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．O％～97．1％、86．9％～97．3．[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性.     

两株H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析

采用Pharmacia的TimesavecDNAsynthesisKit结合RT-PCR方法，测定从鸡中的分离的2株H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA全基因cDNA序列。结果表明这2株AIV和从香港地区鸡、鹌鹑中分离的3株H9N2亚型的AIV的亲源关系很近，HA的氨基酸同源性全部高于95％，可能是来源于同一毒株；而与2株从火鸡中分离的H9N2亚型的AIV的来源不同。