基于cry1Ac表达调控元件的苏云金芽孢杆菌表达载体构建

通过克隆cry1Ac基因BtI-BtII启动子、SD序列以及终止子,并引入pET28a的His标签和多克隆位点,在穿梭载体pHT304的基础上构建了一个苏云金芽孢杆菌表达载体pBMB1A。将cry1Ac以及具有非典型BtI-BtII启动子的cry2Ab、cry5Ba、cry6Aa、cry7Ba、cry55Aa 6个基因装载到该表达载体上,转入BMB171构建了重组菌株,通过复红简单染色后的显微镜镜检结果表明,重组菌株BMB1A-1Ac、BMB1A-5Ba、BMB1A-7Ba和BMB1A-55Aa均能形成正常晶体,SDS-PAGE结果也证实这4个重组菌株的重组质粒均能表达出目的蛋白。同时,选取重组菌株BMB1A-1Ac来考察His标签对Cry1Ac杀虫活性的影响,生物活性测定结果显示重组菌株的LC50值与对照菌株相比无明显差异。该载体可用于快速克隆表达不同类别的Cry蛋白。     

苏云金芽胞杆菌Vip3Aa11定点突变对棉铃虫杀虫活性的影响

为了寻找苏云金芽胞杆菌Vip3Aa11中对杀虫活性有重要影响的氨基酸,为杀虫机理研究和改造杀虫蛋白提供理论依据,通过序列比对,利用PCR方法对Vip3Aa11中7个氨基酸位点进行定点突变,对各突变蛋白杀棉铃虫的生物活性进行测定。结果表明,获得的Vip3Aa11突变体I358V、I362M、K553I、I663T对棉铃虫的杀虫活性明显降低,而突变体I706N对棉铃虫的杀虫活性有所提高,各突变体对胰蛋白酶敏感性基本一致。说明第358位、362位、663位异亮氨酸及553位赖氨酸对Vip3Aa11杀棉铃虫活性有重要影响。     

在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白

 【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白，能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性，即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏云金芽胞杆菌片段，本文构建了解离载体pBMB5401，并将上述两个融合基因单独或同时装入解离载体pBMB5401，分别得到重组质粒pBMBcaiiA，pBMB3aiiA和pBMB3439。转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171，随后导入温度敏感型辅助质粒pEG922，重组质粒在整合酶的作用下发生体内重组，消除了抗性基因等非必需片段。【结果】得到3个重组菌BMBcaiiAR，BMB3aiiAR和BMB3439R，在无抗性选择压力下的稳定性均在90%以上。融合蛋白SLH-AiiA及pro3A-AiiA在解离后的重组菌中得到表达，具有对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力。【结论】在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白,可增强其对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力，当同时结合两种方式来表达AiiA蛋白时效果最好。     

苏云金芽胞杆菌cry1Aa19基因的克隆、表达及杀虫活性分析

研究根据cry1Aa类基因的全长序列设计全长引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株LS-R-21的基因组DNA为模板扩增出片段大小为3 600 bp的cry1Aa的全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pEB相连接获得含有cry1Aa全长基因的重组质粒pEB-cry1Aa,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,诱导表达出132 ku的蛋白。该蛋白由1 175个氨基酸组成,其分子质量为132.9964 ku。该基因核苷酸序列已在GenBank中登录,登录号为HQ685121,并且被国际基因命名委员会正式命名为cry1Aa19。杀虫活性测定结果表明,cry1Aa对小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50为1.18μg.mL-1。该基因的获得将为害虫抗性研究及高效工程菌的构建提供了重要的试验材料。     

核型多角体病毒p74基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

 【目的】利用核型多角体病毒（NPV）的p74基因与苏云金芽胞杆菌（Bt）的cry1Ac基因构建融合基因cry1Ac-p74,构建具有广谱杀虫作用的工程菌。【方法】从Bt4.0718菌株中克隆cry1Ac基因及其终止子cry1Act,从苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）中克隆p74基因,以pMD-T作为大肠杆菌亚克隆载体,分别构建含有目的基因片段的T载体pT1Ac、pTp74、pT1Act以及中间载体pT1Act、pTp74Act,获得携带有目的融合基因cry1Ac-p74的表达载体pH1Acp74;该表达载体电转化至Bt无晶体突变株XBU001,得到目的重组菌株XBU-H1Acp74。【结果】XBU-H1Acp74可表达130 kD的Cry1Ac蛋白和50 kD的P74蛋白,生测显示P74蛋白可以协同Cry1Ac的杀虫效果。【结论】本研究成功构建了cry1Ac基因与p74基因融合的Bt工程菌,为进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株,研制出高效、广谱、安全的杀虫剂提供了新的技术途径。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达

【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5 kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS-PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170 ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。     

新型vip3Aa基因的克隆表达及活性分析

采用vip通用引物对苏云金芽胞杆菌TB22-5菌株中的vip基因进行鉴定,克隆得到一个vip3Aa型基因片段。通过生物信息学分析,设计并合成全长引物对vip3Aa型基因完整序列进行扩增,再转入原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,最后对表达蛋白进行杀虫活性分析。序列分析结果表明,此基因序列总长为2 370 bp,预测其编码蛋白由790个氨基酸组成,分子量约为88.5 ku;该预测蛋白质与已报道的Vip3Aa9蛋白序列存在最高的同源性,约为99.1%,该基因被正式命名为vip3Aa66。生物活性分析结果表明,Vip3Aa66蛋白对鳞翅目甜菜夜蛾幼虫具有显著的杀虫活性,其LC50为23.75μg/m L,对鳞翅目的棉铃虫幼虫活性较低,其LC50为243.87μg/m L。vip3Aa66基因可作为一个新的vip基因资源在棉铃虫和甜菜夜蛾的生物防治中应用。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因的克隆及原核表达

[目的]为了分析苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因序列。[方法]以全长基因PCR产物的黏端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pUCM-T相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Ac基因的重组质粒pUCLy1Ac。[结果]cry1Ac基因编码区为3 564 bp,编码蛋白分子量为134 kD,含1 184个氨基酸,与cry1Ac3同源性最高,该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的134 kD蛋白带。[结论]诱导表达的cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性。     

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPFG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达.     

苏云金芽胞杆菌BRC-HZP7杀虫晶体蛋白多样性分析

分离自武夷山土壤的苏云金芽胞杆菌BRC-HZP7菌株对小菜蛾和甜菜夜蛾幼虫有较好的毒杀作用.对该菌株进行了生理生化测定、cry基因的PCR-RFLP检测,以及通过SDS-PAGE检测晶体蛋白,并对蛋白点进行肽段指纹图谱鉴定.结果表明该菌株含有cry1Aa、cry1 Ba、cry1 Ia、cry2Ab、cry2Ac、cr...     

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L.）NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

Toxicity and binding analyses of Bacillus thuringiensis toxin Vip3A in Cry1Ac-resistant and-susceptible strains of Helicoverpa armigera(Hübner)

The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein, Vip3 A, represents a new family of Bt toxin and is currently applied to commercial transgenic cotton. To determine whether the Cry1Ac-resistant Helicoverpa armigera is cross-resistant to Vip3 Aa protein, insecticidal activities, proteolytic activations and binding properties of Vip3 Aa toxin were investigated using Cry1Ac-susceptible(96S) and Cry1Ac-resistant H. armigera strain(Cry1Ac-R). The toxicity of Vip3 Aa in Cry1Ac-R slightly reduced compared with 96 S, the resistance ratio was only 1.7-fold. The digestion rate of full-length Vip3 Aa by gut juice extracts from 96 S was little faster than that from Cry1Ac-R. Surface plasmon resonance(SPR) showed there was no significant difference between the binding affinity of Vip3 Aa and BBMVs between 96 S and Cry1Ac-R strains, and there was no significant competitive binding between Vip3 Aa and Cry1 Ac in susceptible or resistant strains. So there had little cross-resistance between Vip3 Aa and Cry1 Ac,Vip3A+Cry proteins maybe the suitable pyramid strategy to control H. armigera in China in the future.     

Comparative Analysis of Bacillus thuringiensis Vip3Aa57 and Vip3Aa62 Insecticidal Activities

Bacillus thuringiensis (Bt) exhibits strong insecticidal activity and is harmless to non-target organisms such as human and animals. Bt becomes the most commonly used environment-friendly insecticidal microorganism. However, the insecticidal activities of different Bt strains variy significantly. Therefore, it is particularly important to compare the insecticidal activities of different strains and explore their insecticidal effector mechanisms to expand Bt insecticidal spectrum and enrich transgenic resources. Here, the insecticidal activities of Vip3Aa57 and Vip3Aa62 strains, carrying vegetative insecticidal protein-encoding genes that were inserted into the expression vector pET-21b and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) strain, expressing 88 ku protein, were compared. Vip3Aa57 protein reportedly displayed body weight inhibition effect on Spodoptera exigua without affecting Heliothis armigera while Vip3Aa62 protein was known to have strong insecticidal activity against S. exigua (LC50=5.124 ng ? mg-1). A low H. armigera activity (LC50=870.1 ng ? mg-1) was observed. The paraffin sectioning results showed that Vip3Aa57 protein affected S. exigua midgut cell morphology. The laser confocal microscopic imaging results showed that Vip3Aa57 bound to receptors in the midgut without damaging the midgut tissue morphology. This study would be conducive for making full use of Bt strains in the soil to compare the insecticidal activities of different Vip insecticidal genes. It could thus provide significant help in revealing the underlying insecticidal mechanisms of Vip3Aa insecticidal genes, developing new insecticidal proteins and delaying pest resistance problems.     

cry2Aa9m抗虫基因植物表达载体构建及对大豆的遗传转化

cry2Aa9m基因编码的杀虫晶体蛋白(ICPs)对鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Dipter)昆虫具有显著的毒杀作用,可防治大豆食心虫等害虫。试验构建了由豆荚特异性启动子Pmsg调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A,以抗除草剂bar基因为筛选标记,通过农杆菌介导法对绥农28大豆子叶节进行遗传转化,获得抗性株系8株。经PCR和RT-PCR检测结果证明,cry2Aa9m基因已经整合到大豆基因组中并得以表达。研究为抗大豆食心虫转基因育种产业化奠定基础。     

苏云金芽孢杆菌CPB012菌株的杀虫功能基因鉴定及其对害虫的控制作用

【目的】分析并鉴定对马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)具强致病性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CPB012菌株的杀虫基因型,为充分而有效地利用此生防菌奠定基础。【方法】CPB012菌株在LB培养基上30℃培养2-3 d,用苯酚品红进行晶体染色,观察伴孢晶体形态。cry1-cry10杀虫基因的检测选用技术成熟的PCR-RFLP（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism）法,即对某一类基因（如cry1、cry2…）保守区序列设计通用引物,并引入限制性内切酶识别序列,将扩增产物用相应的限制性内切酶处理,得到的酶切图谱可以初步判断杀虫基因多态性。同时结合特异性PCR方法对二、三级分类基因（如cry1A、cry2Aa…）设计特异性引物进行扩增,将扩增产物测序比对。cry11-cry40和vip基因通过设计引物进行PCR检测。菌株在LB培养基上培养24、48、72和96 h分别提取晶体蛋白,结合晶体蛋白的SDS-PAGE图谱分析其表达的杀虫蛋白。室内分别测定CPB012对鳞翅目家蚕(Bombyx mori)、鞘翅目马铃薯甲虫和双翅目橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)的杀虫效果;室内和田间测定CPB012与球孢白僵菌（Beauveria bassiana）MJ07菌株对马铃薯甲虫的生物协同防治效果。【结果】通过菌株形态和晶体形态的连续观察,发现CPB012能够产生方形和球形等晶体。基因型检测表明CPB012菌株含有cry1Aa、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab和vip3A,结合蛋白电泳图谱,其可能分别编码了约135、80、70、85-90 kD的大分子杀虫蛋白;同时可能还含有30和50 kD的两种新蛋白。室内生测试验显示,除马铃薯甲虫外,CPB012对家蚕和橘小实蝇也具有很强的毒杀作用,处理7 d 后死亡率分别为80.30%和76.72%。将CPB012与球孢白僵菌MJ07菌株按0.5﹕0.5剂量混合后室内接种,处理14 d后2龄马铃薯甲虫的累计死亡率达96.5%,极显著地(P<0.01)高于球孢白僵菌MJ07或苏云金芽孢杆菌CPB012单独处理的累计死亡率90.1%(MJ07)或83.3%（CPB012）。多重线性回归方程计算得出单独接种CPB012的LC₅₀为1.88×10⁷ cfu/mL,MJ07的LC₅₀为5.46×10⁷cfu/mL,而二者混用后LC₅₀为1.10×10⁷ cfu/mL,CTC（共毒系数）值为254,增效明显。在田间施用CPB012+MJ07混合剂(0.5﹕0.5)后对1龄和2龄马铃薯甲虫的防治效果分别为47.5%和43.8%, 显著高于MJ07、CPB012和Bt药剂对照的防治效果。【结论】苏云金芽孢杆菌CPB012的杀虫功能由cry1Aa、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab和vip3A等基因所决定,这些基因编码135、80、70、85-90 kD的杀虫毒蛋白。该菌的杀虫谱较广,对鞘翅目、鳞翅目和双翅目害虫都具有很强的生物毒性,其与球孢白僵菌MJ07混合施用可显著提高对马铃薯甲虫的防治效果。     

对甜菜夜蛾高毒力Bt新菌株的PCR-RFLP分析及生物活性测定

利用PCR-RFLP对Bt.新菌株cyz-13,T4-3的基因型进行分析。结果表明,cyz-13含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Bc,cry2Ab4种基因型,其中cyz-13菌株的PCR产物的酶切片断类型不同于已知的基因类型;T4-3菌株含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Ag,cry2Ac,cry1Ia5种基因型。室内生测结果显示,两菌株对甜菜夜蛾、粘虫、棉铃虫、玉米螟均具有高毒力,好于H D-1标准菌株。两菌株的发酵液均有杀虫活性,二者上清的杀虫因子不同。