家蚕幼虫各发育时期酚氧化酶原基因的转录活性分析

[目的]为进一步了解家蚕酚氧化酶原基因的功能奠定基础。[方法]根据GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的cDNA序列设计2对特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测家蚕幼虫各发育时期(蚁蚕到5龄起蚕)酚氧化酶原基因的转录活性。[结果]PPO1和PPO2基因在家蚕幼虫各发育时期的转录活性存在较大差异。PPO1基因在2龄眠蚕、4龄眠中的表达量最高,其次是2龄起蚕、3龄眠蚕3、龄起蚕和1龄眠蚕,在3龄眠中、4龄起蚕的表达量较低,在4龄眠蚕有弱表达,在其他发育时期几乎无表达。PPO2基因除了在蚁蚕1、龄眠中、2龄眠蚕无表达外,在其他时期的表达量均较高。[结论]酚氧化酶原基因在家蚕幼虫各发育时期的转录表达均具有明显的时空特异性。     

家蚕眠期血淋巴酚氧化酶活性变化及其基因表达分析

[目的]探究酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)及酚氧化酶在家蚕眠期血淋巴中的变化规律,为深入解析家蚕眠期酚氧化酶的功能及其基因表达特征提供新线索.[方法]以家蚕四龄将眠、四龄眠(头壳刚开裂)0h、四龄眠6 h、四龄眠12 h、四龄眠24 h和五龄起蚕为试验材料,采用实时荧光定量PCR检测其血淋巴PPO1和PPO2基因的表达情况,并分析血淋巴酚氧化酶活性的变化规律.[结果]家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因在四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期均有一定程度的表达,且两者的变化规律一致,表现为四龄将眠最高、五龄起蚕最低,总体上呈先减后增再减的变化趋势.在家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性整体上也呈先降低后急剧升高再降低的变化趋势,四龄将眠为5.99 U/mg,五龄起蚕为6.02 U/mg,与酚氧化酶原基因表达模式基本一致.[结论]家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性变化规律与酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的转录表达模式基本一致,说明酚氧化酶在家蚕眠期即发挥免疫防御功能,又参与蚕体新旧表皮的更替过程.     

“桑蚕乳酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

为了研究野桑蚕乳酸脱氢酶基因的功能,选择野桑蚕5龄3日幼虫的组织及不同发育时期的个体,利用 PCR 技术对野桑蚕乳酸脱氢酶基因进行克隆,得到野桑蚕乳酸脱氢酶基因开放阅读框长度为996 bp,没有内含子,只有1个外显子。该基因编码的蛋白含有331个氨基酸残基,等电点为6·76,分子量为36·35 kD。氨基酸序列分析表明,该蛋白高度保守,亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要定位于细胞质中。转录表达分析表明,该基因在野桑蚕5龄3日幼虫的组织（马氏管、中肠、表皮、脂肪体、丝腺、血液、精巢和卵巢）及不同发育时期的个体（卵、幼虫、蛹和蛾）中均有表达,且表达量趋于一致。表明乳酸脱氢酶基因在野桑蚕的生命活动中可能具有重要的生理功能。     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

昆虫激素对家蚕血淋巴和体壁酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响

[目的]研究外源昆虫激素对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响,明确昆虫激素对酚氧化酶的调控作用,为深入解析家蚕酚氧化酶的功能及基因表达调控机制提供参考依据.[方法]对五龄第3d发育良好的家蚕幼虫注射蜕皮激素20E和保幼激素JH,以注射等量0.1%二甲基亚砜(DMSO)为对照,分别在注射3、6、12和24 h后解剖家蚕幼虫采集血淋巴和体壁,检测分析家蚕酚氧化酶活性及其基因表达的变化情况.[结果]注射外源JH和20E均能促进家蚕血淋巴酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表达,有效增加酚氧化酶活性.家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因对JH和20E的响应时间存在一定差异,其中,经JH处理后2个酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)仅在处理6和12 h时显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调表达;而经20E处理后PPO1和PPO2基因从3 h开始一直持续到12 h均呈上调表达趋势.JH和20E对家蚕体壁PPO1和PPO2基因的影响恰好相反,具体表现为:JH能有效抑制家蚕体壁PPO1和PPO2基因的表达,降低酚氧化酶活性;20E则促进家蚕体壁PPO1基因上调表达,但不影响PPO2基因表达.[结论]家蚕酚氧化酶原基因PPO1和PPO2表达受JH和20E的调控,且激素对酚氧化酶原基因表达水平的影响与其酶活性变化规律一致,提示酚氧化酶不仅参与昆虫激素的代谢,还与激素协同调控家蚕的蜕皮变态.     

黄粉虫不同发育时期酚氧化酶活性及表达差异研究

[目的]研究黄粉虫不同发育时期酚氧化酶（PO）的活性及其酶原（PPO）mRNA表达量差异。[方法]用3种不同的处理方式处理黄粉虫末龄幼虫、蛹和成虫。24 h后测定血淋巴的PO活性,并通过半定量RT-PCR方法检测PPO的表达量。[结果]PO活性表现出随龄期推进活性加强的趋势,即成虫的活性最高,蛹次之,末龄幼虫最低。没有经过处理时,蛹期几乎没有PPO基因的表达。经细菌处理后,PPO表达量增加,但末龄幼虫最低。[结论]黄粉虫不同发育时期的血淋巴PO活性以及表达量存在差异,具有发育时期相关性。     

野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析

[目的]克隆野桑蚕(Bombyx mandaina)核糖体蛋白L21(RPL21)基因并进行半定量分析,为研究RPL21基因在昆虫体内的生物学功能提供参考.[方法]采用RT-PCR克隆野桑蚕RPL21基因序列,并采用半定量PCR分析该基因在野桑蚕4龄幼虫不同组织中的表达情况.[结果]扩增获得的野桑蚕RPL21基因序列全长为586 bp,其包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度为480 bp,编码159个氨基酸;预测蛋白的分子量和等电点分别为18 kDa和11.01.序列比对结果表明,野桑蚕与其他12个物种的RPL21基因的相似性介于55.5%~91.6%,其中与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)RPL21的相似性最低,与家蚕(Bombyx mori)的相似性最高.半定量分析结果表明,野桑蚕RPL21基因在野桑蚕幼虫的中肠、丝腺、脂肪体、血液、睾丸、表皮、卵巢和脑组织中均有表达,且转录水平无明显差异.[结论]野桑蚕RPL21基因进化较保守,在各组织中分布广泛且表达水平稳定.     

野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析（英文）

【目的】克隆野桑蚕(Bombyx mandaina)核糖体蛋白L21(RPL21)基因并进行半定量分析,为研究RPL21基因在昆虫体内的生物学功能提供参考。【方法】采用RT-PCR克隆野桑蚕RPL21基因序列,并采用半定量PCR分析该基因在野桑蚕4龄幼虫不同组织中的表达情况。【结果】扩增获得的野桑蚕RPL21基因序列全长为586 bp,其包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度为480 bp,编码159个氨基酸;预测蛋白的分子量和等电点分别为18 k Da和11.01。序列比对结果表明,野桑蚕与其他12个物种的RPL21基因的相似性介于55.5%~91.6%,其中与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)RPL21的相似性最低,与家蚕(Bombyx mori)的相似性最高。半定量分析结果表明,野桑蚕RPL21基因在野桑蚕幼虫的中肠、丝腺、脂肪体、血液、睾丸、表皮、卵巢和脑组织中均有表达,且转录水平无明显差异。【结论】野桑蚕RPL21基因进化较保守,在各组织中分布广泛且表达水平稳定。     

槲皮素和硫脲对野桑蚕多酚氧化酶的抑制类型

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)在昆虫的变态发育和免疫防御中起着非常重要的作用,为开发以该酶为靶标的新型害虫抑制剂提供理论依据,以野桑蚕(Bombyx mandarina)五龄幼虫为材料提取多酚氧化酶,探讨了槲皮素和硫脲对该酶的抑制作用。结果表明,这两种抑制剂分别属于竞争性和非竞争性抑制剂。     

野桑蚕蛹体变化的研究

削茧裸蛹保护野桑蚕的蛹体,对该蛹体的发育变化进行了研究。结果表明,野桑蚕蛹期13～44 d,小于茧腔保护的历期32～154 d。根据蛹体颜色、复眼着色、触角着色、体皮松软情况可以分为4级,各级历期依次为:7～32 d、2～25 d、2～10 d和1～15 d。野桑蚕蛹体颜色变化无法精确预测蛹的发育进度。     

菜青虫为害春甘蓝不同生育期对产量的影响及经济阈值的研究

应用均匀设计方法,测定了菜青虫连续为害春甘蓝结球始期和菜球充实期造成的产量损失,并应用生命表方法评价了春甘蓝上有青虫天敌的作用,建立了包括甘蓝生育期和菜青虫种群密度在内的产量损失模型和包含各类天敌作用的防治指标模型。结果表明,产量损失主要是由甘蓝结球始期的虫害造成,捕食性天敌对菜青虫控制作用最大,其排除作用控制指数为4．7107。根据防治指标模型,可求出甘蓝结球始期和菜球充实期以1－2龄幼虫、3－4龄幼虫、5龄幼虫为依据的防治指标,分别为每株14．13头、7．69头、3．44头（结球始期）,29．34头、12．26头和6．93头（菜球充实期）。     

棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析

【目的】克隆获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的cDNA序列,分析HaPEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内HaPEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到HaPEBP的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HaPEBP的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中HaPEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内HaPEBP的变化规律。【结果】获得的HaPEBP cDNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 kD和5.93。氨基酸序列分析表明HaPEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP重组菌用1 mmol·L^-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 kD的融合蛋白His-HaPEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L^-1的咪唑洗涤两次后得到约40 kD的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μl^-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。HaPEBP在棉铃虫幼虫的1-6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内HaPEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g^-1)在6 h就能降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g^-1)在12 h才会降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了HaPEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-HaPEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示HaPEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内HaPEBP的表达量显著降低。     

家蚕的抗氟性及其与数量性状的相关研究

测定家蚕幼虫抗氟中毒的抵抗能力,4龄>3龄>2龄。强抗原种杂变组成的杂种一代,抗性介于两亲之间,弱抗原种杂交组成的杂种一代,其抗性表现出超亲的遗传现象,不同浓度的氟素对品种间的生长发育影响有着显著的差异,说明了品种间的抗氟能力存在着差别;抗氟性与DNV抗性有着显著的相关性;与茧质性状表现为不显著的正相关,抗氟性与蚕血中Ca~(2+)、Mg~(2+)含量无明显的相关关系。     

Polycomb家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达研究

[目的]研究家蚕Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达情况.[方法]根据家蚕基因组预测的BmSu（z）12基因序列,设计特异引物,利用qRT-PCR对该基因在家蚕不同龄期幼虫中的表达进行研究.[结果]BmSu（z）12基因在5龄幼虫蜕皮后2d和变态前2d有较高表达,而在1～5龄取食中期表达量较低,表达特征具有一定的规律性.[结论]BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中具有重要作用,该研究为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能奠定基础.     

烟青虫生物学特性观察

 1996～1997年在云南省红河烟区弥勒县的烤烟大田设置尼龙纱网养虫室,自然条件下连续饲养烟青虫Heliothis assulta(Guene),系统观察各虫态历期、幼虫龄期、取食量及体色变化,幼虫化蛹龄期及成虫羽化、产卵等.结果表明,烟青虫1年发生4～5代,各代均有5龄和6龄幼虫化蛹,5龄幼虫化蛹占60%以上;1龄幼虫历期比2龄历期长,3龄以后龄期增长,末龄(5龄或6龄)幼虫龄期最长;5龄化蛹的幼虫平均历期比6龄化蛹的短;无论5龄或6龄化蛹,3龄以后食量剧增,5～6龄的取食量为1～4龄取食量的1倍以上;幼虫体色多变,1龄幼虫均为红褐色,2～6龄体色变化无规律可循,第2代以后体色有随世代增加而加深的趋向;成虫产卵量与补充营养关系密切,补充营养充足时,每雌可产卵600～900粒,一般情况产400～500粒,未交配雌虫也会产卵,但卵不能孵化.根据观察结果提出了防治中应注意的问题.     

寄主龄期对菜蛾绒茧蜂生物学特性的影响

观察了小菜蛾(Plutella xylostella)被寄生时的龄期对菜蛾绒茧蜂(Cotesia plutellae)发育历期、结茧率及羽化雌蜂寄生能力的影响.结果发现：寄生于3龄小菜蛾幼虫的菜蛾绒茧蜂其卵—幼虫期的发育较寄生于2龄或4龄个体的要快，结茧率及羽化后雌蜂寄生能力要高，但寄生不同龄期寄主个体间的成蜂羽化率没有差异，表明小菜蛾3龄幼虫较2、4龄幼虫对菜蛾绒茧蜂的适合性要高.不同龄期被寄生的小菜蛾幼虫均有部分个体在寄生蜂幼虫成熟啮出前死亡，这种死亡在2龄、3龄时被寄生的个体中主要发生在幼虫期，而4龄幼虫被寄生的个体死亡发生期则逐渐向蛹期转移，4龄第三天被寄生的小菜蛾蛹期死亡率达62.5%，表明小菜蛾4龄幼虫对菜蛾绒茧蜂的适合性随年龄增加迅速下降.文中还讨论了寄主龄期适合性与该蜂产卵选择性的关系.     

甜菜夜蛾不同龄期幼虫药剂敏感性及酶活性差异

采用虫体浸渍法测定辛硫磷、抑太保、高效灭百可、美满对不同龄期甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫的毒力。结果表明2,3,4龄幼虫随龄期增加耐药性增强,2龄幼虫对药剂最为敏感,到3龄后耐药性迅速增强。随虫龄的增加,单头幼虫乙酰胆碱酯酶、磷酸酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶活性显著增强。