重组人胸腺肽α原在单一蛋白生产系统中的高效表达

利用冷休克表达载体构建含有人胸腺肽α原(proTα)编码基因的质粒并在大肠杆菌单一蛋白生产(SPP)系统中表达单一的可溶性蛋白。以proTαmRNA基因序列为模板敲出ACA序列,设计并合成proTα-lessACA目的基因片段后,直接克隆到原核冷休克表达载体pColdⅡ(sp-4)上,将pColdⅡ(sp-4)-proTα-lessACA质粒转化到Escherichia coli BL21感受态细胞中,筛选阳性克隆后采用NdeⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切鉴定。共转pMaz F质粒后,采用冷休克方法表达proTα并采用SDS-PAGE检测鉴定。结果成功构建重组表达质粒pColdⅡ(sp-4)-proTα-lessACA,经冷休克表达后在E.coli BL21(DE3)菌中获得大量单一的proTα。原核表达质粒pColdⅡ(sp-4)-proTα-lessACA构建和单一proTα在SPP系统中表达的成功,为进一步研究proTα结构和生理功能提供帮助。     

H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列,合成HA基因;定向克隆到原核表达载体p ET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-HA;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot法鉴定。结果显示,重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;重组的HA融合蛋白约为84 ku,大小与预期融合蛋白大小一致;重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合,与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组HA融合蛋白表达。     

重组胸腺素α1在大肠杆菌中的表达

重组胸腺素alpha 1(Tα1)基因在大肠杆菌中进行表达.根据大肠杆菌密码子偏爱性合成Tα1基因并连接到pMD18-T载体上,双酶切回收的Tα1插入到pET32-α后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,经15%SDS-PAGE检测,胸腺素α1获得可溶性表达.检测到与目的蛋白相对分子量(21.8 kDa)相符的条带.重组胸腺素alpha 1在大肠杆菌中获得可溶性表达.     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

金花茶CnCHS基因原核表达载体的构建及表达分析

根据已经克隆得到的金花茶（Camellia nitidissima Chi．）查尔酮合成酶基因序列,设计引物对P1／P2扩增出该基因全长并将其构建到原核表达载体 pGEX 4T 1中,转入大肠杆菌BL21后,用浓度为0．4 mmol／L的IPTG诱导其表达。SDS PAGE电泳检测结果显示,被诱导的大肠杆菌菌体中出现了约68 ku的特异融合蛋白,表明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

牛结核杆菌mpb-83基因的扩增和表达

采用PCR方法扩增牛结核杆菌mpb-83基因，并将其连接到T3克隆载体，然后克隆到原核表达载体PET-32a中，构建重组质粒PET-32a—mpb-83。以重组质粒转化大肠杆菌BL21，用NI柱纯化，最后纯化产物在SDS—PAGE中检测。结果得到约664bp的目的片段，且MPB-83可在大肠杆菌BL21中高效表达。     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

猪α干扰素原核表达载体的构建及表达

以重组克隆质粒pGEM-T-IFN-αZ为模板,PCR扩增杂种猪α干扰素,将其插入原核表达载体pET-43.1a-c( )中,构建了猪α干扰素原核表达载体pET-IFN-α,实现了猪α干扰素在大肠杆菌BL21中的表达.SDS-PAGE电泳、Western-blotting检测均出现了特异性的条带.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白以可溶性形式存在.经薄层扫描分析,表达产物约占菌体总蛋白的29.8%.     

重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建及表达

构建重组人ICOS胞外区原核表达载体,并进行初步表达.根据GenBank基因库中ICOS胞外区基因序列设计引物,用RT-PCR法从人T淋巴瘤细胞Jurkat的总mRNA中扩增出ICOS胞外区基因并运用重叠延伸PCR技术扩增出ICOS胞外区同源二聚体,并将ICOS胞外区同源二聚体插入到原核表达载体PET-28a中,并对重组质粒进行鉴定.转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白.结果获得ICOS胞外区同源二聚体基因大小为757bp,构建的重组表达载体中目的基因序列完全正确.IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约为31ku.这说明成功地构建人重组ICOS胞外区同源二聚体的原核表达载体,并实现在大肠杆菌中大量表达.为下一步蛋白纯化及制备抗ICOS单克隆抗体奠定了基础.     

橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达

克隆新疆野生橡胶草顺式异戊烯转移酶基因,对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究该基因的功能和植物体内天然橡胶合成分子机制奠定基础。采用同源克隆法结合RT-PCR技术获得目的基因,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。结果表明:该基因开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸,推测的蛋白分子质量为34.9ku,理论等电点为8.74;具有cis-异戊烯基转移酶的5个高度保守区,属于cis-IPPS superfamily蛋白家族;系统进化树表明,橡胶草顺式异戊烯基转移酶与短角蒲公英的亲缘关系最近;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。可见,利用RT-PCR技术从橡胶草叶片中克隆得到顺式异戊烯转移酶基因,成功构建原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到表达。     

小麦矮秆基因Rht3和赤霉酸不敏感基因Gai3与a—淀粉酶的表达

以小麦赤霉酸反应不敏感的Ｒｈｔ３矮秆基因两个近等基因系及其分离群体为材料,分析了Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３与ａ－淀粉酶表达的相互关系。结果表明,Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３能强烈地抑制萌发籽粒ａ－淀粉酶的表达,降低ａ－淀粉酶活性水平。高矮亲本间ａ－淀粉酶活性差异明显,矮扬３、矮苏３和扬麦３号、苏麦３号的ａ－淀粉酶ＯＤ值分别为０．０７１,０．０８０和０．０６３５,０．７２０。经Ｘ＾２测验,两群体中ａ－淀粉酶生高、中、     

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。     

性别决定基因Sry原核表达载体的构建和蛋白检测

动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状，而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动，获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料，通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体，使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry；使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达，而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白，对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因植物表达载体的构建及瞬时表达

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特点,被认为是肿瘤凋亡疗法较有希望的候选药物。植物生物反应器在药用蛋白质生产方面具备较大优势。构建了可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的植物表达载体,进行本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,并对目的蛋白的体外活性进行检测。结果显示,本氏烟叶片中目的蛋白平均表达量为68.60 pg/mg TSP;在浓度为200 pg/m L时,对NCI-H460细胞株的抑制率为28.75%。研究表明,经密码子优化的编码基因能够在受体植物中表达出有活性的目的蛋白,为开展目的基因的稳定转化工作奠定了基础。     

MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果。经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10~(-4) mol/L IPTG浓度在37℃诱导6 h。     

籽鹅FSH真核表达载体的构建及表达

为了构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并检测其在籽鹅颗粒细胞中的瞬时表达。利用PCR技术合成籽鹅FSH全基因后,构建促卵泡素α、β亚基真核表达载体,并转染籽鹅卵泡颗粒细胞。结果表明:基因片段已正确插入真核表达载体,同时在颗粒细胞中检测到pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β的融合蛋白表达。说明已构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并在颗粒细胞瞬时表达成功,为研究和开发生物制剂奠定基础。     

凋亡素融合基因原核表达载体的构建及可溶性表达

在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-22b-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达。软件分析结果表明表达蛋白占菌体蛋白的20%,上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。