烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

异常线粒体基因ORF25可能导致烟草雄性不育

克隆和测定烟草胞质雄性不育系MS革新3号及其保持系革新3号线粒体基因ORF25的序列.结果表明:保持系的ORF25基因序列能推导出完整的氨基酸序列,应该具有正常的生物学功能;而雄性不育系的ORb25基因序列与保持系有较大差异,共有11个位点发生了变化,特别是在89位点发生的碱基C→A的变化及336位点发生的碱基T→A的变化,使得雄性雄性不育系在这2个位点出现终止密码子(TAA和TCA),导致不育系的ORF25基因不能推导出完整的氨基酸序列,使该基因不能产生完整的蛋白质多肽.因此,烟草雄性不育系的ORF25基因不能发挥其在保持系中所发挥的作用,这是否与烟草的雄性不育性有关还有待于进一步深入研究.     

红菜薹温敏型胞质雄性不育相关基因的克隆与表达分析

根据GenBank中orf224和atp6基因的保守序列设计特异引物对红菜薹温敏型(Pol)胞质雄性不育系的基因组DNA进行特异扩增,获得了红菜薹Pol胞质雄性不育特异基因orf224p和atp6p的DNA序列,红菜薹orf224p和atp6p基因与已报道的orf224和atp6基因的同源性高达100%。运用半定量RT-PCR对atp6p基因在不同器官中的表达水平进行了分析。结果表明,不育系花期叶片中该基因的表达量比蕾(长度小于0.5mm)和雄蕊中的明显低,在后2个器官中的表达量无明显差异;而在保持系的上述3个器官中的表达量无明显差异。该结果显示,atp6p基因表达上调与孢原细胞分化受阻相关。     

烟草不育系与保持系线粒体DNA的重测序研究

基于重测序技术,对两对不育系和对应的保持系材料的线粒体DNA进行重测序,统计并分析了不育系与保持系线粒体DNA编码区序列的突变位点,探讨了这些突变位点与烟草胞质不育的关系。对重测序结果比对分析可知:不育系和保持系在orf106b上具有一致的1个In Del位点,在orf138a、orf121b、orf129b和orf110b上具有一致的SNP位点,这些突变位点没有造成不育系与保持系编码区序列的差异,推测这些突变位点可能与CMS无关;不育系MSK326和MSK394在orf112a和orf103c上有相同的In Del位点;MSK326和MSK394在65个基因片段或开放阅读框上有一致SNP位点,且这些突变没有出现在保持系线粒体编码区。这些基因片段或开放阅读框上的In Del和SNP突变都导致了基因或开放阅读框编码序列的改变,并且造成了氨基酸的突变,推测可能与烟草CMS密切的相关。其中atp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf25、nad6、nad7、orf108、orf239、orf129、sdh4等基因或开放阅读框上的突变位点与报道研究一致,均被报道与烟草CMS存在密切的联系。本研究所挖掘的这些大量基因片段上的In Del和SNP位点,不仅有助于烟草CMS机理的进一步研究,也为烟草不育系育种研究提供有力的遗传工具。     

不结球白菜细胞质雄性不育相关基因BcATPA的克隆和表达分析

[目的]本文旨在克隆不结球白菜BcATPA(ATPase alpha subunit)基因并研究其功能及其在不育系和可育系中的表达差异。[方法]构建BcATPA重组质粒,在NCBI数据库进行核苷酸序列分析,得到不结球白菜ATPA基因全长序列。利用实时定量PCR技术检测BcATPA基因在不结球白菜保持系和不育系的不同组织和器官及不同小孢子发育时期的时空表达情况。[结果]获得了不结球白菜ATPA基因全长序列,命名为BcATPA。该基因的核苷酸序列全长为1 806 bp,其最大开放阅读框长度为1 527 bp,编码508个包含F1-ATP酶α亚基保守区域的氨基酸,并且含有ATP结合、walker A motif和walker B motif等位点,而且在287～315的位置含有29个氨基酸的跨膜区域。BcATPA与芸薹属中的芥菜、甘蓝型油菜和拟南芥亲缘关系特别近,二级结构和三级结构预测表明,该基因与ATP结合有关。实时荧光定量PCR结果表明,BcATPA在不育系中的表达水平高于保持系,在花瓣、萼片中表达水平较高。在整个小孢子发育时期,不育系中BcATPA基因表达量逐渐降低;而在保持系中,从四分体时期开始显著下降,因此不育系与保持系表达量差异逐渐加大。[结论]BcATPA基因在不结球白菜不育系和保持系的各个器官和整个小孢子发育时期的表达水平存在差异,研究结果为进一步研究BcATPA基因与细胞质雄性不育之间的关系提供了理论依据。     

甘蓝细胞质雄性不育类型的分子鉴定

为鉴定几种来源不同的甘蓝细胞质雄性不育材料的类型,获得与其不育性状相关的特异序列,基于同源序列的候选基因法,通过检索NCBI核苷酸及蛋白质数据库获得orf138和orf224开放阅读框序列,依据其保守序列设计2对引物,对甘蓝的5个不育系及其保持系进行PCR扩增.orf138引物在5个甘蓝雄性不育系中均扩增出749 bp的片段,同源性比对发现这5个不育材料的特异片段与萝卜 Ogu CMS所具有的 Ogu orf138基因同源度达100%,表明这几个来源不同的甘蓝细胞质不育材料同属萝卜细胞质不育类型.     

萝卜细胞质雄性不育的分子鉴定及orf138/orfB基因序列差异性分析

【目的】本研究旨在了解萝卜雄性不育细胞质的分子特征。【方法】以8份萝卜细胞质雄性不育系及其保持系、5份不育材料及6个萝卜品种为试材,利用线粒体基因orf138及orf B为分子标记,设计特异引物对材料进行扩增,并对扩增产物进行测序分析。【结果】8份萝卜细胞质雄性不育系、5份不育材料及5个萝卜品种检测到含有orf138特异片段,为Ogura胞质类型,不育系相应保持系则未检测到特异片段;对扩增产物测序发现所有Ogura胞质材料可分为2种类型,Type A和Type H;27份材料orf B特异扩增后,其产物按编码区核苷酸序列的差异可分为2个类型,Ogura胞质中序列一致,普通胞质中序列一致。【结论】由此可见,orf138与orf B基因在Ogura胞质与普遍胞质间均差异明显,可利用orf138的有无及orf B基因的核苷酸序列差异进行胞质类型鉴定。     

甘蓝雄性不育系及保持系的开花结实特性研究

以甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata)不育材料08126和08131作为不育系,08703作为保持系,从现蕾期至采收期,调查比较其物候期、生长势、花器官结构形态以及结实情况。结果表明,不育系与保持系的物候期基本一致,能与之配套。不育系在生长势、花器官结构形态方面均表现出了雄性不育系的特点,人工授粉后,结实情况良好。所以08126和08131可以作为今后甘蓝育种的新型不育材料。     

小麦不同细胞质雄性不育系及其保持系ATP酶同工酶比较

对普通小麦L型、V型和T型细胞质雄性不育系及相应保持系幼苗的ATP酶同工酶进行了检测。结果表明，L型不育系在幼苗照光后出现的独有ATP酶谱带A10，可能是叶绿体和核基因共同作用的结果；而V型不育系在幼苗的任何时期取样，都出现的一条独有的ATP酶谱带A3，可能是线粒体和核基因共同作用的结果。不同类型不育系及相应保持系的幼苗ATP酶表达状况不同，不仅反映了一种复杂的核质互作关系，并且也暗示了不同类型不育系其不育机制可能不同。     

玉米C型细胞质雄性不育花药不同发育时期的转录组分析

【目的】通过分析玉米C型胞质雄性不育“三系”材料花药不同发育时期的转录组数据,以期阐明玉米C型胞质的不育和恢复机制,并解析不育基因与恢复基因之间相互作用的调控网络,为玉米C型细胞质雄性不育在不育化制种中的利用提供理论依据。【方法】以中国玉米生产上的骨干自交系豫自87-1为背景的C型胞质不育系、保持系、恢复系为材料,通过对3种材料减数分裂的前期Ⅰ、中期Ⅰ及末期Ⅱ（四分体）时期的花药进行转录组测序并利用hisat2、ballgown及DESeq2等工具进行生物信息学分析,寻找三系花药不同时期、相同时期不同材料间以及发育时序中差异表达的基因,预测C型胞质不育机制与育性恢复的调控网络;同时通过实时定量PCR对测序分析结果进行验证;通过酶活测定验证推测的C型胞质不育及恢复假说。【结果】所有材料的转录组测序共产生156.59 Gb的序列数据,比对并组装共得到53 035个基因;在恢复系与不育系、保持系与不育系以及“三系”花药不同时期之间共筛选出非重复差异基因5 676个,其中发育阶段差异基因4 705个,同时期材料间差异基因2 693个,发育时序差异基因135个。GO分子功能分析显示ATP和DNA结合相关的基因和锌离子结合基因得到高度富集;细胞组分中膜基本组分、核内及质膜内的基因得到富集;以DNA为模板的转录、转录调控、氧化还原及初级代谢等生物学过程中的基因得到富集。KEGG分析表明,差异基因主要富集于氧化磷酸化、碳代谢及糖酵解等能量代谢相关的途径中。不育系相对保持系而言,多个与氧化磷酸化相关的基因下调表达,而恢复系中不但相应基因的表达水平得到恢复,而且同时协调调节了同一能量代谢途径中的其他基因,定量分析显示差异基因的表达差异及趋势与转录组测序结果基本一致。ATP酶活结果表明不育系相比保持系,ATP酶活显著降低,恢复系中由于恢复基因的作用其活性得到大幅恢复。【结论】玉米C型胞质不育基因引起基因表达变化可能发生在减数分裂中期Ⅰ之后,末期Ⅱ之前;玉米C型胞质不育的形成可能是由于不育基因引起的能量亏损所致,而恢复基因则通过能量补偿促使育性得以恢复。     

orf224基因与芸薹属种间杂种雄性不育性的相关性

orf224是在甘蓝型油菜(Brassica napus)波里马(Polima)胞质中发现的一个与细胞质雄性不育(Cytoplasmicmale sterility,CMS)相关的线粒体基因.大白菜(B.campestrisssp.pekinensis)CMS系CMS3411-7是由Polima不育系和大白菜自交系3411-7杂交后,以3411-7为轮回亲本经多代回交选育得到的.以CMS3411-7为母本分别与小白菜(B.campestrisssp.chinensis)自交系S71、大白菜自交系K1和菜心(B.campestrisssp.chinensisvar.utilis)自交系B1杂交得到3个杂交种CS71、CK1和CB1.以CMS3411-7、CS71、CK1和CB1为材料,以Polima为对照,利用多聚酶链式反应(Polymer-ase chain reaction,PCR)技术与田间实验育性观察相结合的方法,研究了orf224与几个芸薹属种间杂种雄性不育性之间的相关性.结果显示:在这4个材料中尽管均含有orf224基因,但CMS3411-7和CB1表现为雄性不育,CS71和CK1表现为雄性可育.这就表明,orf224虽是CMS的因子,但它必须和核基因进行互作才能发挥作用.     

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

烟草感染青枯菌前后POD及同工酶的变化

【研究目的】对烟草感染青枯菌前后的根、茎、叶内过氧化物酶(POD)及同工酶进行比较研究,为抗病育种提供理论基础。【方法】采用比色法测POD酶活,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行POD同工酶的比较。【结果】对烟草感染青枯菌前后,酶活性测定结果表明,烟草叶部POD活性显著高于根部和茎部。烟草接菌后,根、茎、叶内的POD活性均在第3天升至最高,而叶内比对照增高了29.67%。同工酶电泳分析表明,烟草接菌后的同工酶谱带,在条带的数目、种类和各条的相对活性上表现出差异。【结论】POD作为植物的保护酶类,随植物抵抗疾病的过程变化而变化,故与植物抗病性密切相关。     

烟草质膜ATPase4基因的克隆、表达载体构建及表达分析

植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H⁺,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。     

小黑杨碳酸酐酶家族基因表达特性分析

本文克隆了小黑杨CA家族的6个基因成员,分别命名为PsnCA1、PsnCA2、PsnCA3、PsnCA4、PsnCA5和PsnCA6,其中PsnCA4和PsnCA6属于α碳酸酐酶家族,PsnCA1、PsnCA3和PsnCA5属于β碳酸酐酶家族,而PsnCA2属于LbeatH超基因家族。系统进化分析表明,亲缘关系较近的是PsnCA2、PsnCA4和PsnCA6,而PsnCA1、PsnCA3和PsnCA5聚为一大类。通过实时荧光RT-PCR技术研究了小黑杨根、茎、叶中PsnCA基因的表达模式,结果表明:除PsnCA6外,其余5个基因在叶部的表达量显著高于根和茎。在叶部表达量最高的为PsnCA1,在茎部和根部表达最高的为PsnCA3。PsnCA在各部位的表达均受暗处理的影响,其中各基因在根部的表达变化最大,其次为茎和叶。      

水稻乙酰乳酸合成酶基因的克隆和功能分析

乙酰乳酸合成酶（ALS）是植物和微生物中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸合成途径的一个关键酶，该基因在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值。利用生物信息学分析，自水稻中分离了ALS基因的cDNA和基因组DNA序列。序列分析表明，ALS基因没有内含子，GC碱基含量高并不对称分布。软件预测ALS基因是单拷贝基因位于第4号染色体上，Southern杂交验证了此结果。构建A岱基因的植物表达载体并转化烟草，转基因烟草通过PCR-Southern验证。EXACT-RT-PCR结果表明，水稻ALS基因在转基因烟草的叶片和根部均有转录发生。利用甲嘧磺隆进行除草剂抗性测试，和对照烟草相比转基因烟草除草剂抗性高达50mg·L^-1。     

拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMT)启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7～10.9倍。结果表明MPBQMT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

甘蓝型油菜Polima和Shan 2A CMS的orf224基因的序列分析

【目的】油菜Polima CMS的线粒体基因组中含有orf224的4.5kb的区段是与细胞质雄性不育相关的，验证Shan2A CMS与Polima CMS在orf224的差异性。【方法】根据orf224设计5′端和3′端的1对特异引物，对Polima CMS和Shan2A CMS的线粒体基因组进行PCR扩增，在Shan2A中得到与orf224同源的DNA片段，对其测序分析。【结果】两序列均由675个碱基组成，核苷酸同源性为99.3％。【结论】证实Shan2A CMS与Polima CMS的orf224基因上存在差异，不能简单的从两者具有共同的恢保关系上说明Shan2A CMS就是已知的Polima CMS。     

Molecular identification of the cytoplasmic male sterile source from Dongxiang wild rice(Oryza rufipogon Griff.)

The use of cytoplasm male sterility(CMS) is crucial for three-line hybrid seed production. Two types of CMS have been discovered from Dongxiang wild rice, namely the wild abortion type CMS(CMS-WA) and the Dongxiang wild type CMS(CMS-DW). In this study, we show the molecular identification of the two types of CMS in Dongxiang wild rice. WA352, which conferred CMS-WA, was not detected in Dongxiang wild rice, implying Dongxiang wild rice does not carry the CMSWA source. Further analysis of WA352 in DY1A, a CMS-DW line, by PCR amplification and sequencing, revealed two insertion-deletion polymorphisms occurred in CMS-DW compared to WA352 of CMS-WA. It was reported that WA352 was comprised of an unknown origin sequence and partial sequences of three open reading frames(ORFs), orf284, orf224 and orf288. The 42-bp insertion was located between the two segments of orf224 and orf288, which created a new chimeric ORF, orf216. This new ORF was also detected in CMS-HL. Based on the 9-bp deletion in orf284, a specific mitochondrial marker of DW-M1 was developed, which could be used to specifically distinguish the DW-type source. Moreover, semi-quantitative RT-PCR analysis preliminarily suggested that both orf216 and orf284 could be considered as candidates for CMS-DW. These findings present a preliminary understanding of CMS-DW at the molecular level.