牛SOCS5基因5'调控区多态性研究

[目的]筛选SOCS5基因启动子区多态位点(SNP),并研究其对启动子功能元件的影响.[方法]选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池,直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响.[结果]牛SOCS基因5调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为:C-577T、T-43C和C+61T,其中C+61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点.生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS5基因表达水平.[结论]牛SOCS5基因5'调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点.     

鸡TGF-β2基因启动子区多态性分析

为了研究鸡TGF-β2基因启动子区的SNP及其对启动子功能元件的影响,采用PCR-SSCP方法对16个鸡种的TGF-β2启动子区的554~824 bp(即3号染色体的19 433 476~19 433 746 bp)进行基因分型,经测序,共检测到3个有效的SNPs位点,分别是679位点的C/G,699位点的G/A,774位点的T/C。其中大骨鸡和太湖鸡在3个位点均检测到SNP存在,AA鸡在3个位点都没有发现SNPs。分别利用生物信息学软件JASPAR和MethPrimer预测TGF-β2基因启动子区转录因子结合位点和CpG岛,发现SNP位点可改变转录因子结合位点且位于CpG岛上,表明TGF-β2启动子区SNPs可能通过不同方式影响基因表达调控。     

鸡NLRC5启动子区转录调控序列的初步研究

为了探讨NLRC5启动子的潜在调控机制,将NLRC5基因启动子系列缺失片段插入到pGL3-basic载体,构建重组质粒,并转染DF1细胞系。通过双荧光素酶实验寻找核心调控区,然后用目标捕获测序检测27个鸡品种的NLRC5核心启动子区的SNPs,并利用TRANSFAC,JASPAR和Meth Primer预测该区域的转录因子结合位点和CpG岛。结果显示,NLRC5启动子有2个核心区域,分别是1—617和1448—2108。第一个核心区域内存在3个SNPs,其中SNP1影响转录因子Hic1的结合序列,但SNPs对CpG岛不产生影响,表明NLRC5基因的启动子区的调控可能受不同因素的影响,但SNPs并不在甲基化的水平上影响启动子的活性。     

不同牛种SOCS6基因5'调控区多态性分析

为筛选SOCS6基因启动子区域单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)并研究其对启动子功能元件的影响,选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建DNA池,直接测序筛选SNP位点.结果表明,SOCS6基因5'调控区存在4个SNP位点,分别为T-513G、C-401T、A-332G和T-180G.生物信息学软件预测得到SOCS6基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近部分转录因子结合位点消失和新位点产生.多态性位点对转录因子结合位点有显著影响,但并不改变CpG岛大小.     

牛SOCS5基因5′调控区多态性研究

【目的】筛选SOCS5基因启动子区多态位点（SNP）,并研究其对启动子功能元件的影响。【方法】选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池。直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响。【结果】牛SOC5基因5′调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为：C-577T、T-43C和C＋61T,其中C＋61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点。生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS基因表达水平。【结论】牛SOCS5基因5′调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点。     

贵州本地山羊POLRMT 基因启动子区 SNP 的生物信息学分析

为给贵州本地山羊肉质品质选育工作提供更好的科学依据,以贵州白山羊、贵州黑山羊及黔北麻羊为 试验对象,探究肉质相关基因POLRMT 启动子区SNP 位点对肉质品质的影响。通过构建DNA 池筛选出SNP 位点, 并采用多种生物信息学软件预测核心启动子范围、CpG 岛及转录因子。结果表明,POLRMT 基因启动子区存在2 个 SNP 位点,分别为T-81A、T-289C。POLRMT 基因核心启动子范围发生改变,SNP 位点导致部分转录因子结合位点消 失,MethPrimer预测到CpG 岛增加1 个。     

不同猪种乳铁蛋白基因启动子区单核苷酸多态性分析

通过构建DNA池和测序,分析了广东蓝塘猪、大花白猪和外来长白猪3个猪种的乳铁蛋白基因启动子区和部分5'UTR区1 494 by的单核苷酸多态性.结果表明,在3个猪种中发现了24处单核苷酸突变,其中12处为转换,8处为颠换,3处为插人.1处为缺失突变.通过生物信息学方法预测了猪乳铁蛋白基因启动子转录因子结合位点,发现了5个SNP:-1032A>G、-989C>T、-740T>G、-732G缺失、-680A>G,分别位于PEA3、cAMP、STAT5、SRY转录因子结合位点上,其中-1032 A>G产生了MYTI结合位点,-680A>G导致了SRY结合位点消失,引起了转录因子结合位点的改变,但是否对启动子转录活性有影响还需要进行深人研究.     

鸭SCD1基因启动子多态性对血清生化指标的遗传效应

[目的]分析鸭SCD1基因启动子多态性与血清生化指标的遗传效应,揭示鸭SCD1基因启动子的生理调控机制,为今后开展畜禽SCD1基因研究及遗传标记选育提供参考依据.[方法]构建基因组DNA池,利用PCR-RFLP结合DNA直接测序技术检测鸭SCD1基因启动子区遗传变异情况,采用MegAlign寻找SNP位点,通过在线启动子分析软件预测SNP位点对鸭SCD1基因启动子g.952260~g.954527区域转录因子的影响,并以SPSS 19.0分析启动子酶切位点变异对父母代樱桃谷鸭血清生化指标的遗传效应.[结果]从樱桃谷鸭SCD1基因启动子g.952260~g.954527区域共检测到11个SNPs位点.其中,g.952323C>A和g.952661A>G位点突变分别致使原有转录因子D1和Sp1消失;g.952702A>G位点突变则产生新的转录因子TEC1;g.952591T>C、g.952868A>T、g.952869T>G、g.952971G>C和g.953301T>C突变区域无转录因子结合位点,也未产生新的转录因子结合位点;g.952873T>G和g.954401T>C位点突变未引起转录因子改变;g.954239C>T位点突变导致原有转录因子Sp1、Sp1、Tra-1和AP-2α改变为Sp1、Tra-1、ETF和Sp1.通过PCR-Bgl II-RFLP和直接测序比对分析,发现g.952868A>T和g.952869T>G双碱基突变造成原始序列AGT952868G952869CT突变成AGA952868T952869CT,而产生新的Bgl II酶切位点,共产生3种基因型:CC(2268 bp)、CD(2268+1659+609 bp)和DD(1659+609 bp),2个等位基因(C和D).CC基因型和C等位基因分别为优势基因型和优势等位基因,其频率分别为0.710和0.805;有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)分别为1.458和0.265,属中度多态位点;卡方(χ2)检验结果表明,Bgl II酶切位点突变所产生的基因型分布严重偏离哈代—温伯格平衡(χ2>χ20.01,P<0.01).Bgl II酶切位点变异与父母代樱桃谷鸭血清生化指标的关联性分析结果表明,总体上以DD基因型樱桃谷鸭的血清生化指标略优于其他两种基因型.[结论]樱桃谷鸭SCD1基因启动子g.952260~g.954527区域共筛查到11个SNPs位点,其中g.952868A>T和g.952869T>G位点变异产生新的Bgl II酶切位点,且该酶切位点变异可能对鸭血清生化指标有调控效应.     

鸡TGF-β2基因启动子区多态性分析

为了研究鸡TGF-β2基因启动子区的SNP及其对启动子功能元件的影响,采用PCR-SSCP方法对16个鸡种的TGF-β2启动子区的554~824 bp(即3号染色体的19 433 476~19 433 746 bp)进行基因分型,经测序,共检测到3个有效的SNPs位点,分别是679位点的C/G,699位点的G/A,774位点的T/C。其中大骨鸡和太湖鸡在3个位点均检测到SNP存在,AA鸡在3个位点都没有发现SNPs。分别利用生物信息学软件JASPAR和Meth Primer预测TGF-β2基因启动子区转录因子结合位点和Cp G岛,发现SNP位点可改变转录因子结合位点且位于Cp G岛上,表明TGF-β2启动子区SNPs可能通过不同方式影响基因表达调控。     

转录因子Sp1对成肌细胞中猪SKIP的表达调控作用

利用基因组PCR步移方法获得猪SKIP转录起始位点上游2 075 bp启动子序列。生物信息学分析发现该序列中存在4个Sp1结合位点和1个CpG岛。将启动子序列构建到pGL3-basic的双荧光素酶报告基因载体上,再利用RNA干扰技术分析转录因子Sp1对SKIP转录的影响。荧光素酶活性分析发现Sp1的表达抑制使成肌细胞中SKIP启动子活性显著下降,表明转录因子Sp1可能通过顺式作用元件GC-Box对成肌细胞分化过程中SKIP基因的转录激活起正向调控作用。     

广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆及其活性分析

[目的]克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础.[方法]通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性.[结果]发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个CpG岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段.成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P<0.05).[结论]成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段.     

猪HIF-1α基因启动子区及编码区的生物信息学分析

利用生物信息学方法,对NCBI中公布的猪缺氧诱导因子HIF-1α基因的5'端上游2 000 bp长度的候选启动子区进行了核心启动子及转录结合位点的预测;同时对其所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、高级结构及进化关系进行了分析.结果显示:猪HIF-1α基因5'端上游存在潜在启动子区,存在CpG岛,存在多...     

猪RELMβ基因启动子区克隆及序列分析

本研究旨在分析猪RELMβ基因启动子结构,初步探索RELMβ基因表达调控机制。通过PCR方法扩增RELMβ基因的系列启动子缺失片段并分别克隆到荧光素酶报告基因表达载体p GL3-Enhancer中,经酶切、测序和生物信息学分析,构建包含RELMβ启动子系列截短的荧光素酶报告基因重组质粒,脂质体转染至HT29和293T细胞,应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子活性。试验获得了猪RELMβ基因约1 kb的启动子序列,序列比对发现猪和人物种间相似性仅34.9%,猪和小鼠的同源性是82.4%。生物信息学分析预测猪RELMβ基因转录起始位点在-556 bp处,猪和人RELMβ基因启动子存在系列保守的转录因子结合位点,包括Cdx2、SRY、NFKB、NKX-2、c-Myb、GATA-1、GATA-3、C/EBP、MZF1等。细胞检测结果显示,p GL-RELMβ(-574~+215)活性最强,推测在-574~-182 bp位点之间存在RELMβ基因启动子的关键顺式调控元件,这一区域发现SRY、Cdx2、GATA-1和MZF1等关键转录因子结合位点。     

藏猪和大约克猪FBXO32基因多态性及表达差异分析

为明确FBXO32基因在高原藏猪与大约克猪肌肉中的表达差异性，选取这2个猪种作为试验动物，采用双脱氧测序技术对藏猪(33头)、大约克猪(32头)FBXO32基因的5′UTR启动子区进行单核苷酸多态性(SNPs)筛选，利用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术检测FBXO32基因在藏猪、大约克猪腿肌及背最长肌组织中mRNA的相对表达量。研究结果表明，在FBXO32基因的5′UTR启动子区筛选到了G-257A和A-556G这2个SNPs位点，且SNPs位点在2个猪种群体间的基因型频率有着显著性差异(P<0.05);通过转录因子预测，发现这2个SNPs位点与肌细胞的更新、分化和增殖相关，推测FBXO32基因的SNPs位点是调控肌肉生长的关键位点；藏猪腿肌、背最长肌组织中FBXO32基因的mRNA相对表达量都显著高于大约克猪(P<0.05),由此推测FBXO32基因可以负向调控肌肉生长，这可能是导致高原藏猪生长速度慢的主要原因之一。本研究结果为进一步探究FBXO32基因在猪肌肉生长相关的调控机制提供了必要的理论依据。     

绵羊D1x3基因启动子活性及其多态性与羊毛品质性状的关联

[目的]通过开展绵羊D1x3基因启动子结构、活性、多态性及其与羊毛品质性状的关联等分析,揭示D1x3基因在绵羊毛囊发育中的作用及其作用机制.[方法]采用PCR扩增D1x3基因起始密码子上游1.5kb区域,利用荧光素酶报告基因技术分析D1x3基因启动子活性,采用测序方法寻找D1x3基因启动子区SNP,并利用PCR-RFLP技术进行SNP分型.[结果]①D1x3基因启动子近端序列的保守性较高,该区域内人、鼠及绵羊都具有23个保守的转录因子结合位点和一个CpG岛,而启动子的远端序列的保守性较低;②D1x3基因的启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中具有启动子活性;③D1x3基因启动子的-1 551-1 108 bp与-1 108-707 bp区域对启动子活性影响较大;④D1x3基因启动子区SNP位点(G-1166A)多态性与羊毛卷曲度显著相关.[结论]①D1x3基因启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中有活性;②D1x3基因启动子的近端序列组成在人、鼠和绵羊中较为保守,而其远端序列的保守性较低,但是D1x3基因启动子的远端序列对启动子活性影响较大;③D1x3基因启动子区G-1166A位点是羊毛卷曲度的一个分子标记.     

猪TCAP基因转录因子的筛选与鉴定

克隆了猪TCAP基因1 662 bp的启动子序列,序列分析发现其启动子区域存在Myo D、Myo G、MEF2转录因子结合位点,并构建了3个转录因子超表达载体,分别与TCAP基因启动子载体共转染PK细胞。结果表明,3个转录因子使TCAP基因启动子活性升高,均正调控TCAP基因的表达。     

牛PEG11基因生物信息学分析

采用生物信息学方法对牛PEG11基因进行分析,为进一步揭示该基因生物学功能和其分子调控机理奠定基础。选取6种哺乳动物PEG11基因的CDS序列作为研究对象,进化分析表明:包括牛、羊、小鼠、熊猫、猪和人在内的6种哺乳动物间的遗传距离小于0.109,且牛与猪遗传距离最小,为0.036,与基因进化树分析结果一致。CpG岛在线软件预测显示,在牛中该基因上游5kb内没有CpG岛。启动子在线软件预测和转录因子分析相结合显示,启动子可能位于该基因5′端上游2 181～2 131bp处,此区域包括大量潜在转录因子结合位点,并在2 173bp处存在一个TATA框。蛋白质在线软件分析表明,PEG11基因编码一种螺旋形跨膜蛋白质,有α-螺旋、β-转角和自由卷曲3种二级结构。     

奶牛COL1A2基因启动子区甲基化与其基因表达及乳腺炎的相关性分析

本研究分析奶牛健康乳腺组织和金黄色葡萄球菌感染的乳房炎乳腺组织中胶原蛋白Ⅰ型α2链基因(COL1A2)启动子区CpG岛甲基化与COL1A2基因表达的调控关系,为奶牛乳房炎的抗性育种及预防提供理论依据。利用生物信息学,分析COL1A2基因启动子区CpG岛分布及其转录因子结合位点;运用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)和RT-PCR法,分析健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中,COL1A2基因启动子区的CpG岛甲基化程度与COL1A2基因表达及乳房炎的相关性。结果表明健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中CpG岛甲基化差异不显著(P0.05),均呈低甲基化状态(50%),但位于转录因子SP1结合区域内的第4和第5 CpG位点,健康组甲基化程度(30%和60%)显著高于患乳房炎组(0和10%);健康组基因表达水平显著低于患乳房炎组(P0.05)。说明,COL1A2基因在不同乳腺组织中的差异表达可能与其启动子区CpG岛转录因子SP1结合区域内的第4和第5CpG位点甲基化程度差异相关。     

江口萝卜猪STAT3基因多态性及生物信息学分析

【目的】明确碱基突变对江口萝卜猪STAT3基因mRNA二级结构及其编码蛋白二、三级结构的影响,为更好地开发利用江口萝卜猪种质资源打下基础。【方法】利用江口萝卜猪血样提取基因组DNA构建DNA池,采用混合DNA池结合PCR产物直接测序的方法对STAT3基因进行多态性分析,筛选出SNP多态位点及估算等位基因频率,并进行生物信息学分析。【结果】从江口萝卜猪血样中扩增获得STAT3基因的24个外显子,并筛选出7个SNPs位点,分别是:Exon2-A~(19)C、Exon2-G~(20)C、Exon2-G~(74)A、Exon4-T~(81)A、Exon5-G~(57)A、Exon5-C~(64)A和Exon22-C~(43)A。其中,Exon2-G~(74)A、Exon4-T~(81)A和Exon5-G~(57)A为同义突变,不改变其编码氨基酸序列;Exon2-A~(19)C、Exon2-G~(20)C、Exon5-C~(64)A和Exon22-C~(43)A为错义突变,会导致其编码氨基酸发生改变。Exon22-C~(43)A突变后致使最小自由能降低为-755.90 kcal/mol,结构稳定性增强;Exon2-A~(19)C、Exon5-G~(57)A和Exon5-C~(64)A突变均促使最小自由能增加,分别为-754.00、-753.40和-752.60 kcal/mol,且导致m RNA二级结构改变,结构稳定性降低,其中Exon5-G~(57)A突变导致mRNA二级结构完全改变。Exon2-A~(19)C、Exon2-G~(20)C、Exon5-C~(64)A和Exon22-C~(43)A突变均可导致编码蛋白二、三级结构的改变,具体表现为α-螺旋增加、β-折叠减少,而无规则卷曲除Exon2-A~(19)C突变呈增加趋势外,其他突变均呈减少趋势。其中,Exon2-G~(20)C突变对蛋白二级结构影响最大,而Exon2-A~(19)C突变的影响最小。【结论】从江口萝卜猪STAT3基因的24个外显子上检测出7个SNPs位点,其中Exon2-A~(19)C、Exon2-G~(20)C、Exon5-C~(64)A和Exon22-C~(43)A 4个为错义突变,除了造成编码氨基酸改变外,还导致mRNA及编码蛋白二、三级结构的改变,进而可能对STAT3蛋白的功能造成影响。     

小鼠胞内氯离子通道5基因启动子核心功能区域鉴定及转录调控分析

为研究胞内氯离子通道5基因(Chloride intracellular channel 5,CLIC5)广泛参与调节细胞内的各项生理活动与生化反应,并探讨该基因自身的表达调控机制,以小鼠基因组序列为模板,利用PCR技术扩增小鼠CLIC5基因5′上游调控序列,将其插入荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中,同时采用5′侧翼区缺失的方法构建了7个缺失不同DNA片段的荧光素酶表达载体。重组质粒与海肾荧光素酶载体(phRL-TK)共同瞬时转染HEK-293细胞,经双荧光素酶报告基因活性分析后,确定CLIC5基因的核心启动子区。利用生物信息学方法预测其中转录因子结合位点及启动子区甲基化状况。结果表明,CLIC5基因启动子缺乏TATA盒,但含有典型的GC盒及其他潜在转录因子结合位点;双荧光素酶报告基因活性分析表明,CLIC5基因-329～+1、-624～+1、-917～+1和-2 230～+1区域的启动子活性较高,其中-624～+1区域的启动子活性最强。进一步分析表明,启动子区-624～-329存在负性调控元件,预测存在转录因子结合位点RXR heterodimer binding sites与GC-Box factorsSp1/GC,-420～-283范围内存在CpG岛位点。