茶尺蠖核型多角体病毒多克隆抗体的制备及检测应用

以纯化的茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EcobNPV)作为抗原免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,Indirect-ELISA效价为1∶51 200;工作浓度分别为EcobNPV 1∶1 600、兔抗血清1∶3 200。用所制备的多克隆抗体对提纯的多角体进行Western-blot分析表明制得的抗体对茶尺蠖核型多角体病毒有良好的特异性。应用于不同来源茶园昆虫多角体病毒分离株的检测,取得了理想的检测效果。     

粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）卵巢细胞系克隆株Tn5B1—4特性的研究

通过用限稀释法由粉纹夜蛾Ｔｎ５Ｂ１细胞系中分离出多个细胞株，经筛选获得一个理想的克隆株Ｔｎ５Ｂ１－４，该克隆株的特性不同于原细胞系Ｔｎ５Ｂ１。该克隆株的细胞形态一致，细胞群体倍增时间较原细胞株短，而且细胞活力强，特别是在维持粉纹夜蛾单粒包埋核型多角体病毒的复制能力方面高于原细胞系，另外经生物测定看出，在该克隆株中增殖的病毒毒力与虫体内增殖的病毒无显著差异。     

粉纹夜蛾核型多角体病毒在同源寄主细胞系中复制和连续传代的研究

本文研究了粉纹夜蛾单粒包埋核型多角体病毒(TnSNPV)在同源寄主细胞系Tn5B_(1—4)中的生长特性。结果表明,接种36h 后,无包涵体游离病毒(TnSNPV—NOV)的增殖达到高峰;在60代的连续传递过程中,TnSNPV-NOV 毒力随传递代数的增加而减低,但不明显。传至60代时仍可保持感染力1×10~5TCID_(50)(组织感染中量)/mL;而多角体的毒力变化十分显著,前几代能使粉纹夜蛾幼虫死亡率迭95%以上,传递到30代以后产生的多角体对粉纹夜蛾的幼虫几乎失去毒力;多角体的产量也明显降低,前几代病毒在每个细胞中可达670PIB,但20代以后,每细胞中多角体的产量仅在100PIB 以下.     

八字地老虎(Xestia c-nigrum)核型多角体病毒的研究

1989年从哈尔滨市郊区罹病八字地老虎(Xestiac-nigrum)幼虫中分离获得八字地老虎核型多角体病毒(X_(c-n)NPV),国内过去未见报道。多角体多为四方形、三角形或不规则形,大小约1.0～2.5μ。由镜下观察病毒粒子杆状,长230～260nm,宽20～30nm。超薄切片观察表明,该病毒为多粒包埋型,多为3～5粒为一束。对2龄八字地老虎幼虫毒力测定表明,8天内的 LC_(50)(致死中浓度)为3.3×10~5PIB/mL。以3.7×10~7PIB/mL 浓度的病毒感染3龄末期幼虫所获病毒产量最高,可用于病毒增殖。     

一株空多角体突变的HaSNPV的发现及其生物学性质初探

[目的]探索一株新的空多角体突变的HaSNPV的生物学性质。[方法]利用同源重组的方法构建HaSNPV细菌人工染色体的过程中,发现一株多角体病毒对棉铃虫幼虫无毒性。通过电镜观察和Western-blot检测对多角体的生物学性质进行了初步探索。[结果]细胞和多角体的电镜结果表明,该病毒能形成正常的多角体外壳,但是不能包装病毒粒子。通过PCR检测,发现其ORF51-54片段缺失,但这一多角体的突变并不与多角体基因和p10基因有关,ORF53(fp25)的回复也证明fp25的缺失不是造成此突变的原因。[结论]该突变株将为HaSNPV基因功能的研究提供良好的技术平台与研究素材。     

粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵巢细胞系克隆株Tn5B_(1-4)特性的研究

通过有限稀释法由粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)Tn 5 B_1细胞系中分离出多个细胞株,经筛选获得一个理想的克隆株Tn 5 B_(1-4),该克隆株的特性不同于原细胞系Tn_5B_1。该克隆株的细胞形态一致,细胞群体倍增时间较原细胞株短.而且细胞活力强,特别是在维持粉纹夜蛾单粒包埋核型多角体病毒(Tn SNPV)的复制能力方面高于原细胞系。另外经生物测定看出,在该克隆株中增殖的病毒毒力与虫体内增殖的病毒无显著差异。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株同源重复区hr1的结构功能分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirusⅡ,SpltNPVⅡ)基因组DNA同源重复区hr1大小为1 746 bp,含有6个64 bp不完全回文序列、4个正向重复序列以及7个与病毒基因组DNA复制相关的基序。瞬时表达分析结果表明,SpltNPVⅡhr1在感染野生型家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)和苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的BmN和Sf21细胞中均具有增强早期基因ie1启动子活性的功能,增强效率分别为30、350倍;实时荧光定量PCR结果显示,hr1在BmN和Sf21细胞中具有基因组DNA复制起始原点的功能,拷贝数分别为(8.46×10~4±6.13×10~3)、(5.92×10~6±2.95×10~5)copies/μg DNA。研究证明,SpltNPVⅡhr1在异源细胞BmN和Sf21中具有复制起始原点和增强子的双功能作用。     

大豆叶毒蛾核型多角体病毒(Oa NPV)的超微结构及形态发生

1987年,在哈尔滨从大豆叶毒蛾Orgyia antiqua(L.)感病致死幼体中分离出核型多角体病毒OaNPV一株。该病毒多角体近圆形,大小约0.4～2.1μm。多角体表面不光滑,有厚约9.0nm的多角体膜。多角体蛋白晶格为线型,晶格均宽约2.66 nm,晶格间距约1.66 nm,两个方向的平行线交角分别为53°和90°。病毒粒子为杆状,大小约62 nm×352 nm。大部分病毒粒子为单粒包埋,但观察到包含2粒和3粒核衣壳的病毒束,病毒粒子外膜为两层膜结构,厚约8.3 nm,内膜厚约2.2 nm。髓核呈螺旋形外观。病毒感染的脂肪体细胞的早期病理变化表现为:核仁消失,染色质凝集,随后细胞核中出现病毒发生基质和核衣壳。核衣壳获得外膜后,被封闭在多角体内。先形成的多角体多在细胞核的外围,多角体数量不断增加,最后充满整个细胞核。     

山西省折带黄毒蛾核型多角体病毒观察

１９８９年，从山西省太谷县采集到的折带黄毒蛾核型多角体病毒（ＮＰＶ）材料经电镜观察，其多角体为三角形，四边形或不规则形。包涵体内的病毒粒子为双粒包埋类型。     

复合型甘蓝夜蛾核型多角体病毒制剂对菜粉蝶幼虫室内毒杀试验

室内试验结果显示,由甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mb NPV)与棉铃虫核型多角体病毒(Ha NPV)按1∶1复合而成的复剂,与甘蓝夜蛾核型多角体病毒单一制剂相比,在相同浓度下毒杀菜粉蝶幼虫效果差异显著(F复=40.38F0.01(5,45)=3.47)。感染病毒的第6、7天测定,甘蓝夜蛾核型多角体病毒复剂对菜粉蝶幼虫的毒杀效果分别是单剂的26.6,54.53倍;浓度为2.0×105,2.0×106的复剂毒杀菜粉蝶幼虫死亡时间比相同浓度下单剂毒杀幼虫死亡时间分别提前了1.285,2.358 d。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制与鉴定

用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，Ｍ４１）作为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过常规淋巴细胞杂交瘤技术产生杂交瘤细胞，经ＥＬＩＳＡ筛选，获得了４株能分泌特异性抗ＩＢＶ单克隆抗体的细胞系，分别命名为４ＡＣ１、４ＡＦ１、６ＤＨ８及２ＤＨ１０。４株单抗的亚类都属于ＩｇＧ２ｂ，在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ试验中，４ＡＦ１、６ＤＨ８２株单抗特异性地识别ＩＢＶ的核衣壳蛋白（Ｎ）；经ＥＬＩＳＡ测定，各株单抗４０ｈ培养上清效价达１０－２～１０－４，第７天腹水效价达１０－５～１０－６，４ＡＦ１、６ＤＨ８与所试７个ＩＢＶ标准株及２个ＩＢＶ分离株都发生反应     

应用抗O抗原单克隆抗体对692个沙门氏菌分离株的分群鉴定

应用抗沙门氏菌菌体抗原O_1、O_2、O_3、O_4、O_7、O_8、O_9,O_(11)、O_(12)、O_(19)一组单克隆抗体(单抗)对692个沙门氏菌分离株进行鉴定,结果A群4株、B群210株、C_1群61株、C_2群109株、D_1群119株、E群182株和F群7株.这一结果与用常规O血清进行的平行试验的鉴定结果一致.同时,这组单抗与172株非沙门氏菌分离菌株不反应.说明这组单抗可以取代常规O单因子血清和A-F群O多价血清用于沙门氏菌的分群鉴定。     

棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒HaSNPV orf101的原核表达及抗体制备

[目的]摸索棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(HaSNPV)orf101编码蛋白原核表达条件并制备其多克隆抗体。[方法]根据HaS-NPVorf101序列,设计引物,引入适当的酶切位点,利用PCR扩增出基因片段并将其克隆至pGEM-TEasy载体,然后亚克隆至原核表达载体pGEX-KG,检测在不同条件下融合蛋白的表达产量及其折叠性质。原核表达产物经SDS-PAGE分离纯化,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。[结果]在IPTG诱导的条件下,融合蛋白GST-HA101可在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物的大小为55.8 kDa。制备的多克隆抗体经1∶8 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号。[结论]原核表达蛋白及其多克隆抗体的获得为深入研究Ha101的基因功能打下了基础。     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。     

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体识别的抗原表位分析

[目的]分析测定口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体（mAb）的抗原识别位点、饱和值、亲和力常数。[方法]利用叠加ELISA法、间接ELISA法、硫氰酸盐洗脱法测定C2D8、B786、B8C9、CAC7、E7C75株mAb的抗原识别位点、饱和值、亲和力常数。[结果15株mAb间具有相似或不同的抗原识剐位点,其中C4C7与E7C7、C4C7与B8C9、E7C7与B8C9等mAb间的识别位点相似．而C4C7与B786、E7C7与C2D8等mAb间的识别位点不同。5株mAbC2D8、E7C7、B8C9、C4C7、B7B6的饱和值分别为1：200、1：400、1：800、1：800、1：800,亲和力为B8C9〉C4C7〉B7B6≥E7C7〉C2D8。[结论]分析测定了5株mAb的抗原识别位点、饱和值、亲和力常数,从而为利用mAb深入研究整联蛋白OtV[36在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。     

抗牛型结核分支杆菌单克隆抗体的制备和鉴定

运用杂交瘤细胞技术,以牛型结核分支杆菌免疫Balb/c小鼠,用其超声波裂解液筛选杂交瘤细胞,得到了2株能稳定分泌抗牛型结核杆菌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5D4和4C3,并对它们的特性作了初步鉴定.经鉴定,2株单克隆抗体均为IgG1亚类.腹水经ELISA检测,效价可达1∶1×104~1∶1×105,同时分析了2株单抗的抗原位点,结果表明2株单抗针对不同的抗原位点.单抗的特异性试验结果显示,2株单抗与大肠杆菌,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌等均没有反应,但都与人型结核分支杆菌有不同程度的交叉反应.并应用免疫胶体金技术制备牛结核杆菌胶体金快速诊断试纸条做应用性鉴定.该试纸条只与结核杆菌发生反应,而不与沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、李氏杆菌等发生交叉反应.该试纸条最低能检测出浓度为1×106个/mL的牛结核杆菌菌液,有较高的灵敏度.     

马立克氏病病毒p79抗原基因在大肠杆菌中的表达特性分析

马立克氏病病毒（ＭＤＶ）的７９ｋｄ蛋白质是该属３个血清型所共有的抗原．用能表达该蛋白质片段的重组噬菌体Ｌａｍｂｄａｇｔ１１克降ＧＢ－２在宿主菌大肠杆萌Ｙ１０９０菌株中表达该蛋白，免疫转印试验中的确产生了能为对７９ｋｄ蛋白质的单克隆抗体Ｔ８１所识别的表达产物。表达过程中，不论加入或不加蛋白分解酶抑制剂，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ中均未显示分子量大于β－半乳糠甘酶的融合蛋白的存在，而是产生了能为单克隆抗体Ｔ８１识别的分子量分别约为５０ｋｄ，３０ｋｄ，２６ｋｄ的３条多肽，用从凝胶中回收的这３条多肽混合物免疫的小鼠血清，在１：４稀释时，与ＭＤＶ感染的ＤＥＦ细胞在免疫荧光反应中呈阳性反应。此外，用抗β－半乳糖甘酶免疫亲和层析柱杜所得到的提纯蛋白质也不被单克隆抗体Ｔ８１所识别．用和不用ＩＰＴＧ诱导的对照试验表明，在该ＧＢ－２克隆中的ＭＤＶｐ７９基因的表达与Ｌａｍｂｄａｇｔ１１表达外源基因的通常方式不同，不需要ＰＴＧ诱导，而是呈现结构性表达的特征，暗示该蛋白质基因的表达并不使用β－半乳糖苷酶基因启动子。     

复合免疫制备3种有机磷农药单克隆抗体的技术研究

以α-氨基丁酸和农药中间体为原料合成了甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱3种有机磷农药人工半抗原(H1、H2和H3);通过活泼酯法将H1、H2和H3分别交联于牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备免疫原和包被原.以等体积混合的 H1-BSA、H2-BSA和H3-BSA复合免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体获4株抗上述复合抗原的单克隆抗体,其中甲基对硫磷1株(H9/A3),杀螟硫磷2株(H9/B3、C8/H6),甲基毒死蜱1株(G7/F5).所获4株抗体的类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链,间接ELISA法测定腹水效价均高达1×106.间接竞争ELISA法测定H9/A3、C8/H6和G7/F5细胞株的抑制中浓度(I50)分别为1070、404和752 μg·L-1,且与类似物无交叉反应.本研究建立了一种可在较短的研制周期内,通过单次细胞融合获得多种不同农药的单克隆抗体的有效方法.     

水稻显矮资源——粳D1半矮生性的遗传分析

用半矮生粳D1与5个籼;粳高秆亲本配组了11个组合。分析F_1、F_2、B_1、B_2株高与相应亲本株高之间的遗传结果表明:粳 D1的半矮生性是不完全显性,受多对独立基因控制,属于加性——显性遗传。其基因的加性效应极显著,显性效应显著。广义遗传力和狭义遗传力分别为81.06%和80.33%。株高负向优势变幅为-2.39～-12.32%,达极显著水平。     

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的研制和鉴定

应用杂交瘤技术,以低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株作为免疫原,制备出3株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株C2C5、D3B10和C2H8。对单抗的特异性鉴定结果表明:腹水单抗C2C5、D3B10和C2H8的间接ELISA效价分别为5×214、210、5×212,但均无HI效价。3株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG2a。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示:单抗C2H8和D3B10与AIV H9N2和AIV H5N1均有60 kD的蛋白条带反应,而不与其他条带反应,表明这两株单抗特异性地针对AIV H9和AIV H5的共同抗原成分60 kD NP蛋白。而C2C5不与电泳蛋白条带反应,说明该单抗不是针对线性表位的,而可能是针对空间表位的。