84K杨树耐盐基因转化研究

在已建立了84K杨叶片外植体再生系统的基础上,利用叶盘法首次开展了84K杨双价耐盐基因mtlD/gutD的转化研究,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了16株卡那霉素抗性转化植株.抗性植株经PCR检测,有4株呈阳性.耐盐实验表明,3株阳性植株抗NaCl能力比对照有不同程度提高.PCR及耐盐实验初步证明双价耐盐基因转化获得成功.     

冬小麦耐盐幼穗无性系变异分析

本文采用两种培养方法筛选耐盐变异体，结果表明，在高盐份培养基础上诱导出愈伤组织后，采用直接转化分法和逐渐提高盐浓度并经低盐浓度长期继代法都可获得耐盐植株。采用前一种方法获得了冀早１５、沧县红和沧县红麦三个材料的再生植株共３４株。经盐池鉴定和水培鉴定其中沧县红和沧县红麦的再生植株后代中有１０株的耐盐性可在Ｒ２和Ｒ３代遗传。采用后一种方法获得了耐２．５％ＮａＣｌ的沧县红麦愈伤组织，其两重植株的Ｒ２代有     

欧美杨107耐盐转基因植株的试验

以欧美杨107(Populus×euram ericanacv.“74/76”)叶片为试材,采用根癌农杆菌介导法进行了胆碱单加氧酶(CMO)基因转化,获得了耐盐转基因植株。试验结果表明,15 mg.L-1卡那霉素(Km)可作为筛选转化细胞的选择压;在农杆菌工程菌液中添加200μmol.L-1的乙酰丁香酮(As)可以显著提高抗性芽诱导率;PCR及Southern检测证明CMO基因已整合进抗性植株基因组;组织培养条件下的植株耐盐性测定及离体叶片电导率测定结果证明,转基因植株的耐盐性得到了提高。     

葡萄糖氧化酶基因转化玉米及其后代的抗病性研究

通过花粉管通道法将葡萄糖氧化酶基因(Glucose oxidase,GO)转入玉米自交系,并对转化后代进行了大斑病抗性鉴定。结果表明,授粉后15～20h为最佳外缘基因导入时间段,最适合的转化质粒DNA浓度为100μg·mL-1。转化获得卡那霉素抗性植株244株,PCR阳性植株13株,对转化的D0代PCR阳性植株的抗病性进行了大斑病抗性鉴定,部分转化植株的抗玉米大斑病能力有所提高,其中3株表现高抗。研究为探索大众化玉米转基因和培育抗病玉米自交系提供了新方法。     

转GhGST基因的棉花植株的获得

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)受黄萎病菌诱导表达,对黄萎病具有抗性。为明确该基因在棉花中抗黄萎病功能,本研究在前期工作基础上,以陆地棉Coker312为受体,利用农杆菌介导的茎尖转化法对GhGST基因进行遗传转化,共获得132株卡那霉素抗性植株,利用PCR检测以及胶回收测序进一步确定了11株稳定的转基因阳性棉植株。转基因植株的获得为后续GhGST基因功能研究及棉花新品种培育提供了基础材料。     

MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系优化研究

为了建立农杆菌介导的高效毛白杨遗传转化体系,并大量获得转MdSPDS1基因的转基因毛白杨,对MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系中关键转化因子进行了优化。获得的优化转化体系如下:叶片预培养3d后,用OD600为0.4的菌液侵染7min,再共培养3d。卡那霉素抗性芽的二次筛选中,卡那霉素的选择压分别为20和50mg/L。实验获得毛白杨卡那霉素抗性植株共43株,经PCR检测,其中9株呈阳性,占抗性植株总数的20.9%,优化转化系统的阳性植株转化率达到9.38%。本研究为下一步鉴定基因功能和转基因植株耐盐性的分析奠定了基础。     

HAL1基因转化烟草及其耐盐性

利用含HAL1基因的高效植物表达栽体pAHF转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens．LBA4404),用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacum L．)叶片进行遗传转化。在含卡那霉素的MS分叱培养基上选择转化体和植株再生,转化植株可在含卡那霉素的生根培养基中生根。经PCR检测发现,在8个转化子中有6个转化子获得特异性扩增条带。耐盐试验表明,在被检测的900株转化子中有481株可在含0．80％～1．50％NaCI的生根培养基中生根,生根率为53．45％,对照烟草植株只在低于0．80％NaC1的生根培养基中生根,生根率为73．75％。由此证明HAL1基因的转入提高了烟草的耐盐性。     

Ri质粒介导TMV和CMV外壳蛋白基因转化烟草的研究

 利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）Ri质粒介导的二元载体法，将pBTC-8质粒上的TMV-cp和CMV-cp基因导入烟草中。采用烟草叶片与农杆菌菌液共培养的方法，诱导出毛状根，经卡那霉素抗性筛选，进一步诱导出愈伤组织并分化再生出完整植株，转化根和植株表现卡那霉素抗性并检测到冠瘿碱的存在。PCR扩增和DNA斑点杂交的结果证明了TMV和CMV外壳蛋白基因已导入到烟草中，同时利用斑点免疫结合法的血清学实验，检测到转化株中有TMV-cp和CMV-cp基因的产物，从而进一步证明了TMV-cp和CMV-cp基因在转化的烟草中得到表达。     

秦美猕猴桃高频遗传转化再生体系的建立

以秦美猕猴桃茎段为外植体,在原代培养成功获得无菌试管苗的基础上,进行愈伤组织诱导培养。将获得的秦美猕猴桃愈伤组织转入再分化培养基中,采用正交设计试验,添加不同种类及不同浓度的植物生长调节物质,组成9种不同的再生植株分化培养基,对秦美猕猴桃愈伤组织进行再分化培养。结果表明,诱导培养基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA暗培养,有利于秦美猕猴桃愈伤组织的形成,诱导率达100.0%;再分化培养基中添加3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+50 g/L蔗糖,能明显提高秦美猕猴桃愈伤组织再分化率。这种方法把诱导愈伤组织与再分化分开进行,可以获得更多的愈伤组织进行再分化培养基的优化,也有利于进行秦美猕猴桃的遗传转化研究。     

IrrE基因转化甘蓝型油菜及其分子检测

为提高油菜的盐胁迫的耐受性,文章以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)下胚轴为转化材料,通过农杆菌介导法将耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans,DR)的IrrE基因导入甘蓝型油菜84100-18(玻里马细胞质雄性不育恢复系)中,经过卡那霉素的筛选培养,获得了抗卡那霉素的再生植株,对抗性植株进行PCR和实时荧光定量PCR检测。结果表明:部分抗性植株多次重复检测显示为阳性植株,初步证实了IrrE已整合到油菜基因组中并且IrrE基因已经在这些植株中进行mRNA水平的转录。     

花粉管介导的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白转基因棉花的筛选

利用新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因进行遗传转化是培育新疆棉花抗寒品种的新途径. 研究采用RT-PCR结合RACE技术从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲(Microdera puntip ennis dzungarica)中克隆获得抗冻蛋白(Antifreeze protein)基因Mp AFP149.将MpAFP149克隆至 pBI121上,获得重组质粒后采用电转化法将重组质粒转入农杆菌EHA105内,PCR筛选鉴定重组子,并测序确定抗冻蛋白植物表达载体构建正确.将pBI121-MpAFP通过田间的花粉管导入技术转化棉花,收取转化的棉花种子,经检测证明在转化10 000朵花中,卡那霉素抗性筛选出 13株,PCR检测有2株阳性植株.实验结果为进一步开展抗冻蛋白基因转化棉花的研究奠定了基础.     

基因枪介导棉花成熟种子胚尖的遗传转化

为建立良好的棉花遗传转化系统,本研究采用基因枪轰击棉花成熟种子胚尖的方法,将本实验室克隆的抗黄萎病相关基因GhDAHPS转化到棉花中。抗生素抗性鉴定结果表明:在基因枪轰击的309个胚尖中,有90株为卡那抗性植株,进一步通过PCR检测这些抗性植株,其中有5株呈阳性,PCR阳性率为1.6%。结果表明:基因枪转化棉花成熟种子胚尖是可行的,相对于其他转化方法,具有操作简便,植株成苗较快,转化周期短等优点。     

烟草转硝酸还原酶基因高效遗传转化研究

通过对农杆茵介导烟草遗传转化方法的优化,建立了快速高效烟草叶盘遗传转化体系.用0D600为0.5的农杆茵悬浮液浸染大小约1.0 cm×1.O cm烟草叶盘5～10 min,再置于MS附加2.25 mg/L 6-BA和0.10 mg/LNAA的分化培养基上,在100 mg/L卡那霉素选择压下,21～28 d可获得抗性不定...     

农杆菌介导法转化大豆体细胞胚获得转基因植株

以六个品种大豆体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对大豆进行了遗传转化,经卡那霉素选择、诱导体细胞胚萌发及壮苗培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中。     

向日葵遗传转化中抗生素适宜筛选浓度的研究

以油用向日葵新葵杂6号品种为材料,采用不同浓度梯度抗生素处理茎尖、子叶、胚轴转化外植体的方法,研究了不同浓度的卡那霉素和潮霉素对向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位遗传转化外植体的筛选效果。结果表明,卡那霉素对向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位转化外植体的筛选适宜浓度为25～30 mg/mL,潮霉素对向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位转化外植体的筛选适宜浓度为7～10 mg/mL;PCR检测结果显示阳性植株外源基因已导入;不同部位的转化外植体对卡那霉素和潮霉素的敏感性存在一定的差异,但未见明显梯度。     

双低油菜农杆菌介导法导入草酸氧化酶基因研究

草酸氧化酶基因(OxO)可将草酸转化为CO2和H2O2,为研究草酸氧化酶基因对植物抗病的作用,本文通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导途径,将草酸氧化酶基因导入了双低油菜,经过诱导分化获得抗卡那霉素抗性的再生植株。经PCR检测得到了与阳性对照一致的470 bp的片段,初步表明OxO基因已整合进油菜基因组中。在诱导接种实验和对草酸的耐受性实验中,转基因油菜植株的抗性明显高于未转化油菜。     

双抗TMV CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定

本研究在已构建ＴＭＶｃｐ和ＣＭＶｃｐ双价植物表达载体,建立辣椒高效遗传转化体系 的基础上,以农杆菌介导的转化法转化辣椒栽培品种：农大４０及湘研一号,对获得的５２株抗卡 那霉素再生植株进行点杂交鉴定及ＰＣＲ检测,点杂交获得１６株ＴＭＶ和ＣＭＶｃｐ基因同时表 现阳性的植株,ＰＣＲ检测发现有２株为假阳性。进一步温室攻毒试验表明,有７株转基因辣椒植 株对ＴＭＶ和ＣＭＶ同时表现免疫。     

转pti5-vp16基因小麦的分子检测和抗病性鉴定

 将携带pti5 vp16基因的pJZ170质粒附着微弹用基因枪轰入辽春 10号、铁春 1号和丰强 3号小麦幼胚 ,2d后检测瞬时表达 ,GUS染色 ,幼胚表面有明显的蓝点 ,单个幼胚蓝点数多达 85个 ;对经ppt2次筛选后的转基因小麦植株进行PCR检测 ,检出 6株阳性植株 ;对部分PCR检测呈阳性的植株进行斑点杂交和Southern印迹杂交检测 ,转基因植株均产生杂交信号。对PCR呈阳性的转基因小麦植株接种小麦白粉病菌 ,接种 7d后 ,病害表型多数为抗病 ;接种 14d后 ,病害表型为抗病、中抗及中感 ,病害严重度明显轻于对照。