新疆小西葫芦黄化花叶病毒的分子鉴定与序列分析

在新疆石河子地区采集具有黄化、花叶和疱斑等症状的多种葫芦科作物,分别提取总RNA,利用小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)特异性引物进行RT-PCR扩增,其中来自黄瓜、甜瓜和丝瓜的模板RNA上可以得到1185bp片段。将扩增得到的片段克隆到pMD18-T上,序列分析结果表明:该片段含有1185个核苷酸,包含完整CP基因。与ZYMV Florida分离物、California、韩国KR-PA分离物、新加坡S及中国北京CH-BJ等GenBank报道的7个不同地域、不同种寄主植物上的分离物序列进行同源性分析的结果显示:ZYMV新疆分离物的CP基因核苷酸与其它11种ZYMV分离物的同源性高达99.42%,氨基酸序列同源性高达98.48%;新疆5个来源于不同寄主植物的ZYMV,不存在明显的遗传变异性,同源性高达97%,而与北京CH-BJ,Reunion和Singapore分离物相比存在较大差异,说明ZYMV地域的相关性要大于寄主上相关性。     

新疆吐鲁番地区三种甜瓜病毒病的发生与分子鉴定

[目的]明确吐鲁番地区西瓜花叶病毒(WMV)、小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)、南瓜蚜传黄化病毒(CABYV)的发生情况及三种病毒不同来源分离物间的遗传差异.[方法]采用分子检测方法,确定吐鲁番地区甜瓜CABYV、WMV、ZYMV的侵染比例,应用序列比对及构建系统发育树分析三种病毒,吐鲁番分离物与国内外其他分离物间遗传差异.[结果]吐鲁番地区40份病毒病样中WMV、ZYMV、CABYV分子检测阳性比例分别达87.5;、50;、30;.ZYMV吐鲁番分离物等部分国内外分离物NIB与CP蛋白之间存在蛋白切割位点Q/S,WMV、ZYMV吐鲁番分离物等部分国内外分离物DAG基序的氨基酸序列均为DAG.依据系统发育树分析将三种病毒吐鲁番分离物分别划分至不同的亚组.[结论]WMV、ZYMV为吐鲁番地区甜瓜病毒病的优势毒原,CABYV为吐鲁番地区甜瓜病毒病的主要病毒之一.CABYV、WMV吐鲁番分离物与国内部分省份分离物亲缘关系更近,ZYMV吐鲁番分离物XJturufan2与东欧、中东国家的分离物亲缘关系更近,ZYMV吐鲁番分离物XJturufan与国内部分省份分离物及美国、西班牙、日本等国分离物亲缘关系更近.     

内蒙古籽用西葫芦病毒病病原鉴定

【目的】对内蒙古自治区籽用西葫芦病毒病进行病原鉴定,并确定其分类地位,为该地区籽用西葫芦病毒病的防治提供理论依据。【方法】以采自内蒙古土默特左旗具有典型花叶症状的籽用西葫芦叶片为材料,对其进行sRNA深度测序和RT-PCR检测,并对所得序列进行一致性分析和构建系统发育进化树。【结果】对具有典型花叶症状的籽用西葫芦叶片的sRNA测序结果进行拼接,在数据库中比对共注释到14种病毒,其中西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（Zuchhini yellow mosaic virus,ZYMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV) 所占比例较高,分别为59.48%,20.70%和13.70%,这说明内蒙古自治区籽用西葫芦病毒病为多种病毒混合侵染引起。RT-PCR扩增除了检测到WMV、ZYMV和CMV外,还检测到马蹄莲潜隐病毒(Calla lily latent virus,CLLV)的外壳蛋白特异性条带。系统进化树分析显示,2个籽用西葫芦ZYMV分离物（MK002236和 MK002237）与伊朗蚜虫ZYMV分离物（KU528623）聚合在同一支;籽用西葫芦Z1 样品WMV分离物（MK015646）与意大利柑橘WMV分离物（FJ823122）亲缘关系最近,而Z2样品WMV分离物（MK015645）则与法国甜瓜WMV分离物、法国未知作物WMV分离物、法国西葫芦WMV分离物以及Z1 样品WMV分离物（MK015646）和意大利柑橘WMV分离物形成一个大分支。【结论】内蒙古籽用西葫芦病毒病主要病原为WMV、ZYMV和CMV,自然条件下常发生复合侵染。籽用西葫芦上最初的WMV和ZYMV可能由媒介昆虫或人从其他作物上传播而来,也可能是通过籽用西葫芦种子进口、国内调运而传播到本地的。     

小西葫芦黄花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析

从辽宁省沈阳市和盖州市分别采集表现花叶的南瓜样品,经透射电镜负染色实验,观察到典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)线状病毒粒子.利用Potyvirus通用引物Legpoty F/LegpotyR分别对3个沈阳样品和3个盖州样品进行RT-PCR扩增,得到预期片段,克隆并测序.Blast显示6个病毒样本与小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)同源性最高,均大于99%.利用已经报道的特异引物ZYMV-F/ZYMV-R,从6个样本中扩增到约1.2 kb的ZYMV片段,片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因.基于CP的核苷酸序列同源性分析,发现2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高,达99.1%和99.4%.系统进化树分析表明,2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14]聚集在一个分支,推测ZYMV辽宁分离物与山西分离物亲缘关系最近.     

江苏省葫芦科作物西瓜花叶病毒的分子鉴定和序列分析

[目的]对江苏各地具典型褪绿花叶症状的多种葫芦科作物是否为西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）侵染进行分子鉴定,明确该病毒在江苏的遗传分化.[方法]提取样品总RNA,利用西瓜花叶病毒的cp基因特异性引物进行RT-PCR扩增,克隆测序,应用DNASTAR和Clustal X软件进行序列分析.[结果]来自南瓜、瓠瓜、西瓜和西葫芦的11个分离物的RNA模板中均检测到1200 bp左右的片段;序列测定表明该片段含1154个核苷酸,包含完整的编码281个氨基酸的WMV-cp基因.序列比对结果表明,11个分离物和来自不同地区的17个分离物WMV-cp基因核苷酸和推导的编码CP蛋白氨基酸序列同源性分别为90.5％～100.0％和92.9％～100.0％.[结论]WMV的遗传变异与地缘相关性较强而与寄主相关性较弱.江苏分离物WMV-CP氨基酸均具有蚜传株系的特征结构域DAG,暗示其田间流行与蚜虫有关.     

小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的RT-PCR检测

小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是葫芦科作物上的一种重要病毒,近几年来已成了我国葫芦科作物上的一种重要病原物。根据已知的ZYMV基因组序列分别设计了2对特异性引物,在优化RT—PCR条件的基础上,成功建立了ZYMV的RT—PCR检测方法。引物ZYM1／ZYM2用于扩增整个CP基因序列（片段长度949bp）,而引物ZYM3／ZYM4用于扩增部分CP基因序列（片段长度449bp）,其中,引物ZYM3／ZYM4的检测灵敏度比引物ZYM1／ZYM2的检测灵敏度高。把所建立的方法用于南瓜（Cucurbita moschata）、丝瓜（如如cylindrica）病叶的检测,结果在这些病叶中也检出ZYMV。因此,该方法可用于ZYMV的快速、灵敏检测及分子流行病学的调查研究。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒的生物学与分子检测鉴定

根据已报道的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染黄瓜的CGMMV广西分离物CP基因片段进行扩增和序列分析,结果表明该分离物与CGMMV-GX-G (DQ647384)同源性最高,达100％.将病毒分离物摩擦接种于5种葫芦科植物、普通烟、心叶烟及苋色藜上,结果表明在葫芦科植物上均...     

湖南省葫芦科作物小西葫芦黄花叶病毒的检测

根据已报道的小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)保守序列设计了一对特异性引物,在58℃下退火30 s,建立了一种可靠、有效的ZYMV普通RT-PCR检测方法。通过该方法成功克隆出一条长度为621 bp的HC-Pro基因片段,并与杭州分离物的ZYMV辅助成分/蛋白酶(HC-Pro)基因核心区域(登录编号为AJ515911.1)的相似度达到99%。采用该方法对湖南省7个地区采集的疑似感病样品进行检测,结果显示:ZYMV平均阳性检出率达54.0%,说明ZYMV是侵染湖南省葫芦科作物的主要病毒之一。     

玉米矮花叶病病原河北株系的分子鉴定和外壳蛋白基因的序列分析

从河北省石家庄地区田间表现典型的矮花叶症的玉米病叶中得到分离物MD-HB,按照报道的马铃薯Y病毒属CP基因前后保守区序列的比较,设计合成了一对引物,采用RT-PCR法扩增了1 2kb的全长外壳蛋白(CP)和病毒基因组的3′末端非编码区(3′-URT)的cDNA序列,将其克隆到pGEM-T载体上,并进行序列分析。结果表明,CP基因由939个碱基组成,编码313个氨基酸并含有与蚜虫密切相关的DAG(Asp-Ala-Gly)序列。Nib/CP基因交界处的蛋白酶切位点为Q/S。与侵染禾本科作物的马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒亚组的4种病毒代表株系甘蔗花叶病毒(SCMV-Ger)、SCMV-MDB、玉米矮花叶病毒(MDMV-A)、高粱花叶病毒(SrMV-H)和约翰逊草花叶病毒(JGMV-O)对应的序列进行比较,结果核苷酸序列的同源性依次为94 4%、84 3%、67 5%、74 2%和60 1%,氨基酸序列的同源性依次为95 5%、87 9%、67 1%、70 3%和58 8%;另一方面,此病毒分离物与来自甘蔗的SCMV株系SCMV-A和MDMV-SC的核酸序列及氨基酸序列的同源性分别为82%、81 1%和83 1%、82 8%,说明它们具有较远的亲源关系。认为应将我国SCMV玉米分离物单独从SCMV划分出来,作为SCMV亚组的一个新病毒种而不是SCMV的一个株系。     

韭葱黄条病毒六安分离物CP基因原核表达与抗体制备

根据已报道的韭葱黄条病毒(LYSV)序列设计引物,扩增LYSV六安分离物的外壳蛋白(CP)基因,序列同源性分析结果表明,与目前已报道的LYSV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为84.0%～95.8%,相应推测出的氨基酸序列同源性为86.8%～97.6%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清.Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1:3 700的一抗,可用于田间LYSV病样检测.     

基于多重RT-PCR技术检测新疆甜瓜主栽区3种病毒病及其分布

采用同源克隆的方法,从新疆感染病毒病的甜瓜中克隆获得WMV、CMV、ZYMV 3种病毒CP蛋白基因的部分片段。并基于单重RT-PCR扩增条件,采用单因素分析法,优化所获得多重RT-PCR的反应体系,利用多重PT-PCR体系对48份供试样品检测。结果表明,多重RT-PCR的检测结果与单重RT-PCR结果一致,说明构建的多重RT-PCR体系具有一定准确性和稳定性,可以用于WMV、CMV、ZYMV 3种病毒的快速检测、病源鉴定、阳性筛选等研究。通过分析甜瓜主要种植区病毒病的多重RT-PCR检测结果,初步得出新疆甜瓜主栽区3种病毒的分布现状与侵染形式,从而为病毒病的防治工作提供依据,以期对新疆瓜果生产中病毒防治,田间检测,流行病学调查以及抗病毒病甜瓜育种等研究提供相应的理论基础与依据。     

Dot-Blot Hybridization for Detection of Five Cucurbit Viruses by Digoxigenin-Labelled cDNA Probes

Dot-blot hybridization was applied in this paper to detect five viruses infecting cucurbitaceous crops,Zuccini yellow mosaic virus(ZYMV),Watermelon mosaic virus(WMV),Cucumber mosaic virus(CMV),Papaya ringspot virus watermelon strain(PRSV-W)and Squash mosaic virus(SqMV),as a good alternative assay in seed health test and epidemiological and transgenic research.Digoxigenin-labelled cDNA probes of the five viruses were synthesized by PCR with the specific primers and applied in dot-blot hybridization to detect five viruses in crude extraction of the infected leaves.And three SqMV probes of different lengths(0.55,1.6,and 2.7 kb,respectively)were designed to investigate the effect of hybridization.The results showed that the sensitivity for detecting the crude extraction of infected leaves by ZYMV,WMV,CMV,PRSV-W,and SqMV was down to 1160,1160,1320,1160,and 1320,respectively.Three SqMV probes of different length showed no differences on the sensitivity and specificity.The digoxigenin-labelled probes prepared by PCR could be used for accurate and rapid identification of 5 viruses infecting cucurbitaceous crops with good stabilities,sensitivities,specificity,and reproducibilities.     

地高辛标记探针检测5种葫芦科作物病毒的斑点杂交方法

 【目的】探索5种葫芦科作物病毒即小西葫芦黄花叶病毒（Zuccini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot virus watermelon strain，PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)的斑点杂交检测技术，为葫芦科作物种子带毒的快速准确鉴定、流行病学研究和转基因检测等提供技术和方法。【方法】以构建的重组质粒为模板，用PCR方法合成了相应的地高辛标记的cDNA探针。通过斑点杂交检测西葫芦病叶汁液来考察探针的灵敏性和特异性。同时设计了3种不同长度的SqMV探针（0.55、1.6、2.7 kb）对杂交效果进行了研究。【结果】ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W和SqMV的5种探针检测各自侵染西葫芦病汁液的稀释低限分别为1﹕160、1﹕160、1﹕320、1﹕160、1﹕320，而每种探针与健康西葫芦和其它4种病毒的反应均为阴性。不同长度的SqMV探针杂交结果相同。【结论】用PCR方法合成的地高辛标记的探针，能够直接在植物组织中将5种病毒检测出来，具有较好的灵敏性、特异性和重复性。探针的长度对杂交的灵敏性和特异性没有影响。     

韭葱黄条病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)是大蒜上的重要病毒病害,几乎分布于全国所有大蒜种植区域,严重影响大蒜的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的LYSVCP基因的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了LYSV黑龙江分离物(LYSV-HLJ)CP基因全长cDNA序列。结果表明,LYSV-HLJCP基因全长885bp,编码295个氨基酸残基;与GenBank中其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%,氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%。依据LYSVCP氨基酸序列建立系统进化树,将LYSV不同分离物划分为4个类群,LYSV-HLJ与韩国和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系,同属于ⅳ类,表现出一定的寄主相关性。     

侵染西番莲的夜来香花叶病毒的分子鉴定及特异性检测

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异性RT-PCR检测方法;序列测定结果利用BLAST程序和DNAMAN软件进行比对,同时对获得的CP基因序列采用Mr Bayes软件的贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建系统发育树并进行系统发育分析。【结果】血清学检测发现,一株表现有花叶、皱缩症状的西番莲样品与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用抗体反应呈阳性;电镜观察结果表明,该株疑似带毒样品中含有大小约750 nm×12 nm的弯曲线状病毒粒子;Potyvirus通用简并引物RT-PCR从该样品中扩增到一条与预期大小相符的目的片段,克隆、测序获得长度为680 bp的序列,该序列与已报道的Te MV核苷酸序列一致性最高(98.2%)。特异性引物扩增获得的CP基因序列全长为816 bp(命名为BXGFJ-13分离物),与已报道的Te MV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系统发育分析结果表明,13个Te MV分离物共形成3个类群,相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出很强的地理和寄主特异性。本研究获得的BXGFJ-13分离物与中国广西分离物(KJ789129)先以较高的后验概率聚为一个分支,再与泰国2个分离物(AM409188、AM409187)聚为第2类群(Group II),表明其在系统发育关系上与中国广西分离物的亲缘关系最近。利用特异性引物Te MV-CPf/Te MV-CPr建立的RT-PCR方法,具有良好的特异性,仅能从感染Te MV的西番莲样品上扩增出目的片段,而从黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus,Bt MV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)等其他病毒样品及阴性对照上均未扩增出目的片段。灵敏度测定结果显示,该方法能从稀释102倍的RNA上扩增出目的片段。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒不同成员的分类标准,同时结合血清学检测、电镜观察结果,证实福建果园表现花叶、皱缩症状的西番莲上携带有Te MV;建立的特异性RT-PCR方法能够用于Te MV的快速检测。     

高粱红条病病原的分子鉴定

从山西高粱红条病病叶中得到一种病毒分离物,命名为GL-SX.根据甘蔗花叶病毒亚组(SCMV subgroup)外壳蛋白(CP)基因C-端和复制酶(NIb)基因C-端的保守序列设计引物,对GL-SX进行免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR) 扩增,获得一条长约1.1 kb的扩增片段,扩增片段克隆后测定序列,该序列含1087个核苷酸(nt),编码362氨基酸(aa),取其中的近全长CP氨基酸序列(296 aa)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)、玉米矮花叶病毒 (Maize dwarf mosaic virus, MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)和约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus, JGMV) 等4种病毒的对应序列进行同源性比较,结果与SCMV的同源性最高(95.3%),而与SrMV、MDMV和JGMV等3种病毒的同源性相对较低,依次为69.3%、69.1%和55.4%.根据Potyvirus属病毒种类划分的标准,将GL-SX鉴定为SCMV.将GL-SX的近全长CP氨基酸序列与SCMV种内各分离物的对应序列进行同源性比较及构建关系树,结果显示GL-SX与SCMV-MDB具有较远缘的种内亲缘关系,而与德国的一个SCMV玉米分离物(SCVM-Hoe)及中国的两个玉米分离物(SCMV-ZJ和SCMV-BJ)具有很高的同源性.     

甘蔗花叶病毒南城分离物外壳蛋白基因序列测定及分析

从江西南城甘蔗病株中获得1个甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)分离物,命名为SCMV-NCH。根据SCMV外壳蛋白(CP)基因N-端和C-端保守序列设计引物,对SCMV-NCH的CP基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,获得924个核苷酸(nt),推断编码308个氨基酸(aa)的近全长CP基因序列。与SCMV亚组SCMV、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、玉米花叶病毒(ZeMV)、白草花叶病毒(PenMV)等6种病毒代表性株系外壳蛋白氨基酸序列同源性比较结果显示,SCMV-NCH与SCMV的同源性最高(86.2%),与其他5种病毒同源性相对较低(56.4%~72.2%)。与SCMV13个分离物外壳蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建关系树,结果显示SCMV-NCH与我国浙江2个分离物(Yuhang和Xiaosh)具有最近的亲缘发生关系。     

芜菁花叶病毒两分离物的CP基因及HC-Pro基因的比较

芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸.两分离物的CP和HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为99.3%和94.5%,氨基酸同源率分别为100%和98.7%.HZWT和YNQC的CP基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率为89.2%～99.3%,氨基酸同源率分别为88.5%～99.7%;HC-Pro基因与TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为80.6%～97.0%,氨基酸同源率分别为95.0%～99.6%.