荧光免疫法、ELISA法与PCR在婴幼儿腹泻常见病毒检测中的价值

目的 探讨荧光免疫法、酶联免疫吸附试验(ELISA)法与聚合酶链式反应(PCR)检测婴幼儿腹泻常见病毒的结果与一致性.方法 对急性腹泻婴幼儿61例分别用荧光免疫法、ELISA法、PCR技术对患儿粪便标本中肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒及诺如病毒抗原进行检测.结果 荧光免疫法肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒及诺如病毒抗原阳性检出率分别为11.48％、11.48％、6.56％及13.11％;ELISA法上述病毒抗原阳性检出率分别为1.64％、27.87％、13.11％及29.51％,PCR上述病毒抗原阳性检出率分别为26.23％、1.64％、1.64％、1.64％.荧光免疫法与ELISA法对比,轮状病毒、诺如病毒抗原阳性检出率差异均有统计学意义(P＜0.05),对于轮状病毒两种方法检测结果有较好一致性;荧光免疫法同PCR对比,肠道腺病毒、诺如病毒抗原阳性检出率差异有统计学意义(P＜0.05),对于轮状病毒及肠道腺病毒,两种方法检测结果有较好一致性;ELISA法与PCR对比,4种病毒抗原阳性检出率差异均有统计学意义(P＜0.05),对于4种病毒,两种方法检测结果有较好一致性.结论 ELISA法与PCR对婴幼儿腹泻常见病毒检测一致性较高,在临床诊断中,可采用ELISA法进行初筛,再通过PCR进行确认,以提高诊断效率及准确性.     

梭子蟹乳化病的间接ELISA诊断

以梭子蟹乳化病的病原菌-溶藻弧菌为抗原,制成免疫血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清(HRP-IgG)为酶标二抗、建立了检测溶藻弧菌的间接ELISA快速诊断法。结果表明,应用间接ELISA技术检测溶藻弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为104cfu/mL。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。人工感染试验48 h后,就能在血淋巴和鳃中检测到溶藻弧菌。应用建立的间接ELISA法进行现场检测,表观有病蟹的阳性检出率为90%,表观健康蟹的阳性检出率为20%,养殖海水中没有阳性检出。     

梭子蟹乳化病的间接ELISA诊断

以梭子蟹乳化病的病原菌-溶藻弧菌为抗原,制成免疫血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清(HRP-IgG)为酶标二抗、建立了检测溶藻弧菌的间接ELISA快速诊断法。结果表明,应用间接ELISA技术检测溶藻弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为104cfu/mL。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。人工感染试验48 h后,就能在血淋巴和鳃中检测到溶藻弧菌。应用建立的间接ELISA法进行现场检测,表观有病蟹的阳性检出率为90%,表观健康蟹的阳性检出率为20%,养殖海水中没有阳性检出。     

检测牛轮状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用

以田间分离的轮状病毒CHLY(G6型)作为抗原,建立了犊牛轮状病毒(BRV)抗体检测与监测的间接ELISA方法.田间监测牛轮状病毒感染率为32.91%(26/79),疫苗源性抗体高峰出现在二次免疫后第40天至第60天,抗体持续期为3个月.该方法可用于粪便、血清样品的检测,具有特异性强、快速简便等优点,适合于对轮状病毒特异性抗体的动态监测和批量检测.     

应用间接竞争ELISA检测山羊痘抗体方法的建立

[目的]为山羊痘疫苗接种山羊后产生的抗体效价检测和山羊痘的诊断奠定基础。[方法]采用Vero-E6传代细胞分离山羊痘病毒抗原,建立检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA方法。[结果]检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA的最佳工作条件：最佳抗原包被浓度为1μg/ml,兔抗高免血清最佳稀释度为1∶16 000,待检血清的工作浓度为1∶400,阳性血清的临界值为45.19%,阴性血清的临界值为38.89%。用该试验建立的ELISA方法检测3 000份接种山羊痘疫苗的山羊血清,阳性检出率为83.33%,琼脂扩散试验检出率为77.33%,竞争抑制ELISA方法较琼脂扩散试验方法敏感。[结论]该方法具有特异性高、快速、敏感等特点,适合检测山羊痘抗体。     

检测鸭肿头败血症病毒的间接夹心ELISA的建立及应用

为了快速诊断和检测鸭肿头败血症病毒抗原,用分离自典型鸭肿头败血症的XD株病毒,制备鸭抗XD IgG、兔抗XD IgG,建立了检测鸭肿头败血症病毒(DSHSV)抗原的间接夹心ELISA法。试验的最佳条件为:抗体包被量为8μg/mL,封闭液为0.5%明胶,抗原孵育条件为37℃1.5 h,兔抗XD病毒IgG浓度5μg/mL,酶标羊抗兔抗抗体浓度为1∶2000,洗涤液为0.02 mol/LpH7.2 PBS。阴阳性结果判定的临界OD值为0.412。重复性试验显示变异系数小于10%。建立的间接夹心ELISA法不与鸭肿头败血症阴性抗原、鸭大肠杆菌抗原、鸭瘟抗原、鸭肝炎病毒抗原呈现交叉反应。敏感性比琼脂扩散实验高1280倍。包被的酶标板在4℃至少可以保存3周。用此方法对人工感染鸭组织脏器中鸭肿头败血症病毒检测结果显示,心、肝、肺、肾检出率最高,脑、脾、胰次之。     

双抗体夹心ELISA检测排泄物PEDV

用蔗糖密度梯度离心法纯化猪流行性腹泻病毒(PEDV)免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术获得2株分泌抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体,建立检测PEDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该双抗体夹心ELISA最佳反应条件为,兔抗PEDV抗体稀释度为1:800包被37℃1 h加4℃12 h,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:2 000作用45 min,以OD490nm≥0.37作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检测限为5×103.67TCID50/m L,并与猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒无交叉反应。用该ELISA方法和RT-PCR方法检测48份临床粪便样品,结果显示,ELISA阳性检出率为39.6%,而RT-PCR方法检测卡的阳性检出率为43.8%。表明双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好等优点,可用于PEDV快速检测。     

间接Dot—ELISA检查猪细小病毒抗原的研究

本研究首次成功地建立了检测PPV抗原的间接斑点酶联免疫吸附试验(Dot—ELISA)标准化程序,在所确定的最适条件下,对纯化PPV抗原的最低检出量为2.5ng/dot,其敏感性为血凝试验(HA)的125倍,但稍低于银加强胶体金检测法(SECGA)。PPV阳性猪血清的特异性阻断试验及与猪瘟病毒,猪伪狂犬病病毒,猪巴氏杆菌的交叉反应试验证明,该方法对PPV抗原的检测具有特异性。以该方法检测PPV人工感染兔样本和自然感染猪样本,PPV抗原的阳性检出率分别为肾样本100％(17/17)、81.82％(9/11),肝样本100％(16/16)、56.52％(13/23)。20份随机样本的间接Dot—ELISA检测结果与病毒分离和鉴定结果相符。 试验证明间接Dot—ELISA对PPV感染的检测具有简单、快速、经济、敏感性高、特异性强、重复性好和便于推广应用等优点,适用于大批量抗原样本的检测,是PPV感染快速诊断和流行病学调查的有效方法。     

2,4-D残留检测的ELISA方法的建立和初步应用

本研究用标准抗原、纯化抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG,建立了间接抑制酶联免疫吸附法,测定了地下水、蔬菜和原粮等样品中的2,4-D含量。结果表明,间接抑制ELISA检测样品中的2,4-D含量变异系数小于15%,样品回收率误差在15%以内;工作曲线表明,在50～2000ng/ml浓度范围内呈良好的线性关系,检测底限为50ng/ml,低于我国规定残留限量(200ng/ml)。因此,本研究建立的间接抑制ELISA法检测地下水、蔬菜和原粮中的2,4-D含量是可行的。     

猪FMDV的VP1结构蛋白特异性抗体间接ELISA的建立

以纯化的FMDV-VP1融合蛋白为抗原,建立了猪口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白间接ELISA检测方法.抗原包被浓度为10μg·mL-1时,血清最佳稀释度为1:40,通过测定30份FMDV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准.结果表明,该方法特异性强,重复性好;对216份送检猪血清用EUSA检测,阳性检出率为31.5%,阴性检出率为68.5%,与HA符合率为96.2%,表明建立的VP1结构蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性.     

抗猪肺炎霉形体血清在几种血清学反应上的研究 Ⅱ高中剂量浓缩抗原免疫家兔的抗血清

制备的猪肺炎霉形提纯浓缩抗原用其高剂量和中剂量免疫家兔所制造的抗血清,与猪肺炎霉形体提纯浓缩抗原在琼脂——凝胶免疫双扩散及免疫电泳上进行了试验,试验前进行了园盘生长抑制试验,代谢抑制试验,微粒凝体试验等检验了血清效价,试验结果表明高、中剂量的猪炎霉形体提纯浓绪抗原免疫家兔所制抗血清,在免疫双扩散及免疫电泳上均产生特异性反应,形成各种不同的沉淀线、抗血清与正常动物血清则不发生反应。建议在使用血清前进行效力测定。     

用双夹心法ELISA检测兔轮状病毒的研究

建立了检测兔轮状病毒抗原的夹心法ＥＬＩＳＡ（ＤＳ－ＥＬＩＳＡ）。用此法检测了６７份兔腹泻粪便样品和腹泻死亡兔肠内容物样品。轮状病毒（ＲＶ）阳性检出率（３１．３４％）明显高于双抗体夹心法ＥＬＳＡ（２５．３７％）和对流免疫电泳（１６．４１％）。经阻断试验和重复性试验，证明了ＤＳ－ＥＬＩＳＡ具有特异性强和重复性好等优点。     

三种免疫血清学方法检测弓形虫抗体的比较

用斑点酶联免疫吸附试验、金萄菌A蛋白酶联免疫吸附试验及间接血球凝集试验二种血清学方法检测弓形虫感染鼠血清及健康鼠血清各100份,平均阳性率分别为96.0％、94.0％和88.0％,平均假阳性率分别为4.0％、7.0％及8.0％;检测10份阿米巴肝脓肿病人血清及20份日本血吸虫感染兔血清,平均交叉反应率分别为3.3％、10.0％及13.3％。结果表明,三法对弓形虫特异性抗体的检测均有较好的敏感性、特异性、重现性及较低的交叉反应率。三法中,以斑点酶联免疫吸附试验的敏感性最好,且有省试剂、反应快、操作简便等优点,是一种很有实用价值前景的免疫诊断方法。     

除草剂2,4-D完全抗原的合成与鉴定

通过活化酯法和混合酸酐法,用牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)合成2,4-D免疫抗原和包被抗原,再分别采用紫外分光光度法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行鉴定.结果是:2种方法合成的完全抗原中2,4-D和蛋白质的偶联比分别为24:1和17:1,抗血清效价为1.28×104～2.56×104.     

猪轮状病毒性腹泻的ELISA双抗夹心法检测及防治建议

[目的]为猪轮状病毒的针对性防治提供建议。[方法]以不同来源、不同饲养方式下218头猪的粪便为材料,用ELISA双抗夹心法检测其中的轮状病毒（RV）抗原,结合流行病学调查对猪轮状病毒的发病因素及发病特点进行分析。[结果]RV多为隐性感染,且感染率较高。从所取218份样品中共检测出RV阳性50头份,阳性率为22．94％,其中,仔猪170头份,阳性率22．35％,中猪48头份,阳性率25．0％;笼养模式下猪的发病率最低,为17．43％,农户圈养方式下猪的发病率最高,达36．84％。[结论]流行病学调查结果显示,仔猪对RV的感染率高于中猪,采取笼养模式,并对仔猪进行RV防治可降低猪RV的发病率。     

莫能菌素人工抗原合成及其多克隆抗体的制备

通过莫能菌素羟基与琥珀酸酐反应,合成半抗原莫能菌素-琥珀酰半酯,采用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联制备人工抗原,以此人工抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体.试验结果表明,莫能菌素结合抗原免疫家兔制备的抗体对莫能菌素具有很高的特异性、亲合性和选择性.用此抗体建立的莫能菌素间接竞争酶联免疫吸附检测方法的标准工作曲线I50值为37.9 ng/ml,最低检测限(I10)为2.09 ng/ml.     

苦参碱人工抗原的合成与鉴定

【目的】合成并鉴定苦参碱人工抗原,以获取具有特异性和高亲和性的苦参碱多克隆抗体,为建立苦参碱的酶联免疫分析方法奠定基础。【方法】通过对槐果碱不饱和双键进行亲核加成、叠氮化、催化氢化合成苦参碱半抗原13氨基苦参碱(ST),并经MS、NMR法对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联合成苦参碱的人工抗原(ST-BSA和ST-OVA),经紫外光谱扫描法、SDS-PAGE法、红外光谱扫描法对人工抗原进行鉴定;将制备的苦参碱人工抗原免疫健康新西兰大白兔获得苦参碱的多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA方法测定其效价。【结果】成功合成了一种苦参碱半抗原13-氨基苦参碱(ST),与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到了免疫原(ST-BSA)和包被原(ST-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价达到128 000。【结论】成功合成了苦参碱人工抗原,为苦参碱免疫分析方法的研究提供了条件。     

酶联免疫吸附试验诊断鹿结核病

本文报告了应用酶联免疫吸附试验诊断鹿结核病的中所进行的抗原筛选、各要素最适稀度、最适作用条件以及所选用抗原的特异性和敏感性等诸方面较系统地研究过程和方法，结果表明，５种抗原在荻取方法，特异性和敏感性的比较中，以ＰＰＤ为最佳，从而建立了以ＰＰＤ为抗原的ＥＬＩＳＡ检测鹿结核病的血清学诊断程序，通过对１２６８头鹿ＥＬＩＳＡ检测结果与变态反结果对比证明：两种诊断方法的阳性符合率为８２％，二者不能互相代替，     

磺胺二甲基嘧啶人工抗原合成及多克隆抗体制备

磺胺二甲基嘧啶(SM2)为只具有反应原性而无免疫原性的半抗原。本试验将SM2重氮化后分别连接人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA),合成人工抗原,经紫外光谱扫描验证偶联结果,计算结合比分别为4∶1、3∶1。用偶联物SM2-HSA免疫新西兰白兔,以SM2-OVA为包被原,4次免疫后ELISA方法测定抗血清效价为1∶12 800。表明抗原合成成功,这为小分子药物残留的免疫学检测奠定了技术基础。     

微量琼脂—凝胶免疫双扩散技术在猪气喘病诊断上的应用

在1981年实验研究的基础上,1982年我们应用自制的猪肺炎霉形体浓缩提纯抗原及自制家兔抗猪肺炎霉形体血清,在忻县的解村农场,忻县曹村大队猪场,长子县种猪场,长子同贺大队猪场及长子食品公司的猪场,进行猪气喘病的免疫双扩散技术诊断试验,同时应用X射线透视及对流免疫电泳技术作对比,检查了各种类型的猪206头,共检出阳性反应猪146头,占被检总数206头的70.87％,其中X射线透视阳性猪81头,占检出阳性猪146头的55.5％;免疫双扩散检出阳性猪131头,占检出阳性猪数的89.7％;对流电泳检出阳性猪115头,占检出阳性猪数的78.8％。在血清学检查的同时挑出8头不同类型阳性反应猪进行了剖检及微生物学检查,均为阳性。不同诊断技术表明:琼扩的检出率最高,X射线透视检出率最低,对流电泳不及琼扩,差异显著,由此认为琼脂——凝胶免疫双扩散技术由于操作简便,特异性高,检出率较高,适用于猪气喘猪的诊断及猪的大批检疫。