利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻ospin9突变体

【目的】生长素输出载体蛋白（PIN-FORMED,PIN）是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据。【方法】根据OsPIN9序列设计特异性编辑位点,构建OsPIN9编辑载体,以日本晴愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法获得抗性植株,通过PCR鉴定转基因植株。转基因植株通过PCR和测序明确OsPIN9的突变类型,获得ospin9纯合突变体并分析突变蛋白与野生型蛋白的差异。qRT-PCR分析突变体幼苗根部OsPINs的表达,进一步明确突变体与野生型对照植株之间的表型差异。以0.05 μmol·L^-1的萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid,NAA）处理幼苗7 d,分析NAA对植株表型的影响。【结果】在水稻OsPIN9第1外显子处设计靶点并构建表达载体,通过遗传转化成功获得18株T₀代转基因植株,测序分析发现转基因株系中有3种不同的突变方式,均为在靶位点的18位碱基处插入不同的单碱基,其中,3株插入T碱基,3株插入G碱基,1株插入C碱基,共获得基因编辑株系7株,进一步鉴定获得2种纯合突变体。序列比对分析表明,这两种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的426个氨基酸缩短为172个氨基酸,跨膜螺旋结构域分析表明突变体中OsPIN9蛋白的跨膜结构完全消失。qRT-PCR分析表明,2个突变株系的OsPIN9转录水平显著降低,OsPIN1a和OsPIN5b表达上调,而OsPIN5a表达受到抑制。幼苗期的表型分析表明,突变体的株高显著低于野生型,不定根数显著少于野生型,但根长没有显著变化。NAA处理下,植株的生长受到抑制,ospin9突变体的不定根数仍少于野生型,但差异已不显著。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻生长素输出载体蛋白OsPIN9进行定向编辑,可获得无转基因成分的基因编辑植株,OsPIN9的突变影响其他OsPINs的表达,ospin9突变体的地上部和地下部的发育都受到抑制,NAA处理能部分恢复突变体不定根的发育。     

基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑

【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。     

假禾谷镰孢转录因子FpAPSES的鉴定与功能分析

【目的】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）侵染小麦引起的小麦茎基腐病严重影响中国小麦的安全生产。查找假禾谷镰孢中的APSES转录因子,分析其在病原菌致病过程中的作用,为解析假禾谷镰孢的致病机制及小麦茎基腐病的防治提供理论依据。【方法】从GenBank获得物种中已知的APSES氨基酸序列,利用BLASTP方法在假禾谷镰孢中查找APSES同源蛋白,利用Pfam软件预测蛋白结构域,采用MEGA5.05构建APSES蛋白的系统进化树。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析A组APSES转录因子基因FpAPSES1和FpAPSES4在假禾谷镰孢侵染过程中的表达。通过PEG介导的原生质体转化和PCR筛选FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株。在PDA培养基上测定假禾谷镰孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突变体菌株的菌丝形态和生长速率;测定在CMC培养液中培养后的分生孢子产生情况、形态以及在无菌水中的萌发率;利用菌丝块和分生孢子接种小麦胚芽鞘和大麦叶片以及盆栽试验测定其致病性;采用ELISA方法测定小米培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的含量。【结果】假禾谷镰孢中有4个APSES同源蛋白,均含有保守的DNA结合结构域HTH。与其他物种的APSES蛋白构建系统进化树,发现FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4属于A组APSES,FpAPSES3分布在C组。FpAPSES1和FpAPSES4在侵染阶段诱导表达,推测可能参与假禾谷镰孢的致病。分别获得2个FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株Δfpapses1-T10、Δfpapses1-T27和Δfpapses4-T1、Δfpapses4-T2。表型测定结果显示,与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在PDA平板上的生长速率明显减慢、色素积累明显增多;FpAPSES1基因缺失突变体菌丝形态无差异,而FpAPSES4基因缺失突变体菌丝弯曲、分支明显增多;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在CMC液体中的分生孢子产生明显减少,分别比野生型下降了99.5%和97.4%,产生的分生孢子变短、隔膜减少、萌发率有所降低;与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体菌丝体和分生孢子对小麦胚芽鞘的致病力明显降低,菌丝在小麦胚芽鞘表皮细胞中的扩展明显受阻;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体对大麦叶片和小麦根部的致病力也明显降低;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在小米培养基中产生的DON毒素分别比野生型下降了约78%和44%。【结论】编码A组APSES同源蛋白的FpAPSES1和FpAPSES4对假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生和致病力均具有重要作用。     

利用CRISPR/Cas9技术研究玉米ZmFKF1在开花过程中的作用

【目的】FKF1是多种植物开花途径中发挥重要作用的关键基因。为研究玉米FKF1功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将ZmFKF1进行定点编辑,获得ZmFKF1编辑突变体。同时以此为材料,通过表型分析及关键开花基因的表达量变化分析,明确ZmFKF1在玉米开花途径中的作用,为玉米分子育种及遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米B104为材料,克隆ZmFKF1,通过序列比对明确ZmFKF1的基因结构。以ZmFKF1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶点,将设计的靶点序列在玉米参考基因组中进行比对分析,排除非特异性靶位点,最终筛选出在ZmFKF1第1外显子上的靶位点ZmFKF1-T1,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体。利用农杆菌介导法,转化玉米B104幼胚,通过抗性筛选获得抗性愈伤组织,之后诱导出芽和生根,获得T₀代ZmFKF1编辑阳性植株,并利用cas9特异引物进行验证。利用靶位点扩增测序法,明确T₁代ZmFKF1编辑植株在ZmFKF1预期靶标位点是否发生突变及突变的类型,筛选获得ZmFKF1定点突变纯合株系。获得这些材料后,以野生型B104为对照,统计和分析开花表型。同时,利用实时荧光定量PCR技术检测上述材料中与玉米开花途径相关的关键基因的表达量变化,对表型进行进一步的验证。【结果】在玉米FKF1的第1外显子上设计靶点构建基因编辑表达载体,通过遗传转化获得的转基因株系实现了对ZmFKF1的定点突变,共获得T₀代ZmFKF1编辑阳性株系18株,在预期靶标位点上发生突变的有6株,2种不同的突变类型：单碱基插入和多碱基缺失。通过开花时间统计和分析,与野生型B104相较,3个T₂代ZmFKF1编辑纯合突变体的开花时间延迟,显著（P＜0.05）晚于B104。进一步对这些材料中的开花关键基因ZmGI、conz1和ZmZCN8进行表达量检测,发现突变体中这些基因的表达明显（P＜0.05）低于野生型B104,与晚花表型相符。【结论】可利用CRISPR-Cas9技术对ZmFKF1进行定点编辑获得基因编辑突变体,且突变体开花时间明显延迟。     

CRISPR/Cas9技术敲除水稻BR降解相关基因的研究

油菜素内酯(BR)是一种常见的植物类激素,在植物的生长发育过程中起重要的调控作用,对水稻株型改良和抗逆性有重要作用。研究首先构建了水稻4个BR降解相关基因的CRISPR/Cas9载体;然后利用农杆菌介导法,将构建好的4个BR降解相关基因的CRISPR/Cas9载体分别转化水稻中花11的愈伤组织,用50 mg/L的潮霉素作为筛选标记,共获得395株转基因植株。其中,有270株属于野生型,61株属于杂合子类型,64株属于突变类型;64株突变体中有39株是杂合突变体,25株是纯合突变体,纯合突变的概率为6.25%。4个基因均获得了突变材料,但不同基因的突变效率不同,其中转LW26的植株突变率高达41%。     

拟南芥类锌指基因AT3G02790/AT5G16470纯合双突变的筛选及其表型分析

以拟南芥T-DNA插入突变体AT3G02790和AT5G16470为亲本,通过人工杂交技术获得杂合体后,结合基因分离定律和PCR技术筛选出拟南芥纯合双突变株,并对拟南芥纯合突变体的表型进行了初步分析,结果显示:突变体与野生型植株表型无明显差异,推测该基因为功能未知的新基因。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11（ZH11）的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T₀代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T₂代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T₂后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。     

2个绵羊群体BMPR-IB基因多态性与绵羊产羔数的关系

旨在探讨BMPR-IB基因在不同绵羊群体中的遗传变异及其与产羔数的关系,利用RFLP技术分析杜泊及滩寒杂交羊群体中BMPR-IB的基因型和基因频率,以及不同基因型对母羊产羔数的影响。结果显示:杜泊羊群体均为野生型,未检测到突变纯合或杂合基因型个体。滩寒杂交群体中突变纯合子(BB型)、杂合子(B+型)和野生型(++型)个体数分别为13、48和120。在滩寒杂交羊群体中,BB、B+及++基因型母羊的多羔率分别为63.64%、47.06%和32.08%;BB型经产个体平均产羔数比杂合型(B+)及野生型(++)个体产羔数分别高出0.5和0.59,而杂合子母羊产羔数高于野生型个体,但差异不显著。表明BMPR-IB基因Fec B突变位点对滩寒杂交群体产羔数有显著影响,因此可通过杂交手段提高后代群体Fec~B基因频率来增加产羔数,但BMPR-IB基因是否为调控杜泊羊产羔数的主效基因有待进一步探讨。     

利用HRM技术对皮南牛MSTN基因C313Y位点快速分型

旨在利用高分辨率熔解(HRM)技术建立一种皮南牛MSTN基因C313Y突变的快速分型方法,进而统计MSTN基因C313Y突变在皮南牛群体中的突变频率,以及突变对生产性能的影响。测量并统计99头皮南牛(母牛)的体尺和体质量指标,然后分别利用Sanger测序法和HRM技术对皮南牛MSTN基因C313Y位点进行分型,并利用一般线性模型分析突变对体尺和体质量指标的影响。结果表明,皮南牛在3岁之后体尺和体质量指标均趋于稳定,平均体高、体斜长、胸围、尻宽、尻长和体质量分别是(127.88±3.65) cm、(154.10±6.89) cm、(181.48±8.54)cm、(46.19±2.94) cm、(50.52±2.65) cm和(471.34±53.78)kg。Sanger测序法和HRM技术对MSTN基因C313Y位点的分型结果完全一致,其中野生型(GG)、杂合型突变(GA)和纯合型突变(AA)的个体分别占8.08%、70.7%和21.21%。关联分析表明,杂合型突变(GA)和纯合型突变(AA)均能够显著提高皮南牛的体尺和体质量指标,其中纯合突变型个体和杂合突变型个体的体质量比野生型个体分别显著提高38.55%和10.32%。成功建立基于HRM的皮南牛MSTN基因C313Y位点快速分型方法,该方法对于快速组建皮南牛MSTN C313Y纯合突变群体,进而有效提高群体的体尺和体质量指标具有重要的应用价值。     

水稻直立短穗突变体esp的转录组研究

【目的】克隆水稻直立短穗基因Erect and Short Panicle（ESP）,分析其参与的基因调控途径,解析ESP控制株型、穗长等农艺性状的分子机理。【方法】以直立短穗突变体esp及其野生型为材料,成熟期进行株高、穗长、粒长等表型测定;构建籼粳杂交F₂定位群体,挑选与突变表型一致的F₂单株,利用与突变性状连锁的分子标记对目的基因进行定位;对野生型和突变体进行基因组测序,结合定位结果,找到突变位点,克隆ESP;利用生物信息学软件进行进化树和基因表达分析;提取野生型和突变体幼穗中的RNA并建库,GO（gene ontology）聚类分析表达差异基因,同时根据KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库,分析野生型和突变体中植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因的表达变化,并通过qRT-PCR验证。【结果】通过表型观察和农艺性状调查,与野生型相比,直立短穗突变体esp株高降低,穗长变短,穗型由弯曲变为直立,每穗粒数减少,粒长变短,粒宽和千粒重增加;有效穗数无显著差异。利用突变体esp与PA64构建籼粳F₂定位群体,将目的基因定位于水稻第7染色体长臂标记C7-11和C7-14之间7.58 Mb区间内,基因组测序发现LOC_Os07g42410第6内含子与第7外显子连接位点由碱基G变异为A,导致第6内含子不能被剪切,蛋白翻译提前终止;该基因与已报道的OsDEP2/OsEP2为等位基因。进化分析显示该基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中;表达分析表明ESP在茎秆、花序、雌蕊、内外稃和子房中高度表达,其表达水平随着子房变大而逐渐降低。利用转录组分析突变体和野生型幼穗中的基因表达,结果表明,与野生型相比,esp突变体中表达差异显著（差异>1.5倍）的基因630个,其中235个表达上调,395个表达下调。GO分析显示植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因受到不同程度地调控,利用qRT-PCR进行验证,结果与转录组数据一致。【结论】直立短穗基因ESP与已报道的直立穗基因OsDEP2/OsEP2为等位基因,其突变导致株高降低、穗长变短等多个表型;ESP可能通过调节植物激素信号转导、内质网蛋白加工过程中的基因表达,进而影响植株的发育。     

MBF2转录调控小菜蛾谷胱甘肽S-转移酶代谢氯虫苯甲酰胺的功能

【目的】探究转录调控因子MBF2 (multiprotein bridging factor 2)调控小菜蛾（Plutella xylostella）体内谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）的功能,及其在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的作用,为阐明小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的解毒代谢机制提供理论依据。【方法】采用浸叶法测定敏感（SS）、广东连州（LZ）、云南通海（TH）3个小菜蛾种群对氯虫苯甲酰胺的抗性水平,酶动力学法测定3个种群的GST活性;使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析MBF2在不同抗性种群小菜蛾中的表达差异;采用氯虫苯甲酰胺LC50诱导12 h,分析其对小菜蛾MBF2的诱导表达作用;应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术研究MBF2对GST基因的调控作用,并测定沉默MBF2后小菜蛾的GST活性;结合沉默后小菜蛾对药剂的敏感性变化,验证MBF2在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的作用。【结果】两个抗性种群（TH和LZ）相较SS种群分别达到了中抗及高抗的水平,TH和LZ抗性倍数分别为54.27和289.58;TH和LZ小菜蛾...     

P450基因在氯虫苯甲酰胺不同抗性品系小菜蛾中的表达及功能分析

【目的】以十字花科蔬菜害虫小菜蛾（Plutella xylostella）为研究对象,筛选参与小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的主要细胞色素P450解毒基因,为阐明不同抗性水平小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机理提供依据。【方法】利用叶片药膜法测定不同小菜蛾种群3龄幼虫对氯虫苯甲酰的抗性水平,通过转录组测序、insectbase数据库和小菜蛾基因组数据库筛选得到52个细胞色素P450基因。应用MEGA5.10软件对52个细胞色素P450基因进行进化分析,获得与抗药性密切相关的CYP3和CYP4家族P450基因。利用实时荧光定量PCR方法分析目的基因在小菜蛾室内筛选种群（HZY）和田间抗性种群惠州种群（HZ）、连州种群（LZ）、东升种群（DS）、钟落潭种群（ZLT）中的表达量,选用RNA干扰技术,采用注射法,验证在抗性种群中显著上调表达的CYP6BF1V4在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的功能。【结果】抗药性测定结果表明,LZ和HZ小菜蛾种群为中等水平抗性,ZLT、DS和HZY小菜蛾种群为高水平抗性。对52个细胞色素P450基因的系统发育树分析发现,小菜蛾拥有10个CYP4家族基因,28个CYP3家族基因,其中2个CYP4家族基因在HZ和HZY种群中的表达量显著高于敏感种群,4个CYP3家族基因表达量与小菜蛾抗性呈正相关,8个基因在中等水平抗性小菜蛾体内的表达量高于在高水平抗性小菜蛾体内的表达量。对田间种群进一步筛选得到6个与小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺密切相关,在不同抗性种群中均上调表达的细胞色素P450基因,其中4个为CYP6家族基因（CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1和CYP6B6）,2个为CYP9家族基因（CYP9G2.1和CYP9G2.2）,以CYP6BF1V4的表达量最高,其在抗性种群中的表达量是在敏感种群中表达量的3.5—6.3倍。RNA干扰结果显示,沉默CYP6BF1V4能够显著提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感性。【结论】CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1、CYP6B6、CYP9G2.1和CYP9G2.2可能在小菜蛾体内协同调控多功能氧化酶的表达,从而加快小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的速度,提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。     

苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白基因鉴定及毒性功能分析

【目的】CAP（Cysteine-rich secretory protein,Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1）超家族蛋白广泛存在于真菌、细菌、动植物等物种,并且参与病原菌的致病过程。本研究旨在鉴定苹果树腐烂病致病菌——苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）的CAP超家族基因并明确CAP超家族基因在病菌致病方面的作用。【方法】通过BLASTP在苹果黑腐皮壳菌全基因组中检索具有CAP保守结构域的基因;利用特异性引物对鉴定到的CAP基因进行PCR扩增和凝胶电泳检测;使用生物信息学软件和在线数据库进行蛋白序列特征和系统发育分析;利用RT-qPCR分析基因在病菌侵染过程中的表达模式;使用特异性引物扩增CAP基因上、下游片段并从PDL2质粒上扩增筛选标记基因;利用Double-joint PCR构建基因敲除盒并通过PEG介导的原生质转化技术进行基因敲除和基因回补;以遗传霉素（G418）抗性为筛选标记并利用4对引物PCR检测获得基因敲除突变体;以潮霉素（HPH）抗性为筛选标记获得基因回补菌株;通过对菌株进行培养皿内生长试验明确基因对病菌营养生长的影响;通过离体苹果枝条接种试验分析该病菌CAP超家族基因的毒性功能。【结果】在苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个具有CAP保守结构域的基因,分别命名为VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c。序列特征分析发现,3个CAP蛋白均包含4个保守区：N端信号肽、N端延伸区（NTE）、CAP保守功能域和C端延伸区（CTE）。系统发育分析显示,3个CAP蛋白聚于不同的进化支,VmPR1a聚于clade2进化支并与粗糙链孢霉（Neurospora crassa）CAP蛋白进化关系较近;VmPR1b聚于clade3且与镰孢菌属（Fusarium spp.）CAP蛋白的进化关系更近;VmPR1c聚于clade1,并且也与粗糙链孢霉的CAP蛋白进化关系较近。RT-qPCR分析结果显示,VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c在病菌侵染早期（6 h和12 h）均显著上调表达。利用PEG遗传转化技术获得VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c敲除突变体（ΔVmPR1a-7/23、ΔVmPR1b-20/31和ΔVmPR1c-26/40）;营养生长观察发现,所有敲除突变体生长表型与野生型菌株03-8均无明显差异;致病力检测发现,ΔVmPR1b-20/31致病力较野生型无明显变化,而ΔVmPR1a-7/23和ΔVmPR1c-26/40致病力较野生型显著下降。将VmPR1a和VmPR1c分别回补至ΔVmPR1a和ΔVmPR1c,回补菌株（VmPR1a/C和VmPR1c/C）致病力恢复至野生型水平。【结论】苹果黑腐皮壳菌中存在3个CAP超家族基因（VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c）,其中VmPR1a和VmPR1c是苹果黑腐皮壳菌重要的毒性因子。     

白星花金龟成虫对10种寄主挥发物的嗅觉行为反应

【目的】筛选出对白星花金龟Potosia brevitarsis Lewis成虫具有引诱活性的挥发物。【方法】使用Y-型嗅觉仪测定了白星花金龟雌、雄成虫对10种寄主挥发物的嗅觉行为反应。【结果】白星花金龟对不同挥发物的嗅觉行为反应具有显著差异,且雌、雄成虫对同种挥发物的嗅觉行为反应存在差异。白星花金龟雌成虫对壬醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇及正己醇具有较强的正趋性;雄成虫则对芳樟醇、1-辛烯-3-醇、正己醇、反-2-己烯醇及正己醛呈现正趋性。【结论】芳樟醇、1-辛烯-3-醇及正己醇可以作为白星花金龟植物源引诱剂的组成部分。     

苹果转录因子MdWRKY40b抗白粉病的机理

【目的】探究苹果白粉病相关基因MdWRKY40b调控苹果抗白粉病的机理,为苹果白粉病的抗性育种提供理论依据。【方法】以苹果品种‘嘎拉’叶片为材料提取总RNA,并以cDNA为模板克隆MdWRKY40b 552 bp特异性片段,采用Gateway技术将该基因片段的正反向序列构建入RNAi表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)中,然后利用农杆菌介导法对苹果叶片进行转化获得转基因植株,苹果叶片选用组培苗茎尖处幼嫩叶片;利用RT-qPCR技术对转基因植株中MdWRKY40b、超氧化物歧化酶基因（SOD）、过氧化氢酶基因（CAT）、过氧化物酶基因（POD）以及β-1,3-葡聚糖酶基因（β-1,3-glucanase）的表达量进行分析;进一步以1年生植株为材料,通过白粉病菌（Podosphaera leucotricha）接种试验,分析转基因植株对白粉病的抗病性;然后以接种白粉病菌后0、5、10、15、20 d的转基因植株及其对照植株叶片为材料,进行氯化硝基四氮唑蓝液（NBT）和二氨基联苯胺法（DAB）染色来分析病菌侵染期间植物材料中超氧阴离子和过氧化氢的积累量,进一步对病菌侵染期间植株中SOD、POD、CAT和β-1,3-葡聚糖酶等酶活性进行测定。【结果】经过PCR检测,确定获得3个MdWRKY40b基因沉默株系,分别为RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3;RT-qPCR结果显示3个转基因株系MdWRKY40b基因沉默效率分别为95.2%、92.2%、79.8%,转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的表达量相较野生型显著上调;人工接种白粉病菌后发现,与野生型植株相比,转基因植株叶片中的粉状病斑显著减少,超氧阴离子和过氧化氢的积累量显著降低,SOD、CAT、POD等调节植物超氧阴离子代谢的抗氧化酶以及抗病相关的β-1,3-葡聚糖酶的活性显著增强。【结论】MdWRKY40b的沉默使得苹果植株对白粉病的抗病性增强,推测转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的上调表达提高了苹果植株对白粉病的基础抗性,导致植物对超氧阴离子的清除能力增加,维持了植物体在响应病菌侵染过程中的低浓度超氧阴离子含量,从而减少高浓度超氧阴离子对植物的损伤。     

马铃薯块茎蛾对不同品种马铃薯块茎的适应性分析

【目的】马铃薯块茎蛾（Phthorimaea operculella）是马铃薯上的重要害虫,严重影响马铃薯的产量和品质。明确马铃薯块茎蛾对不同品种块茎的适应性,为马铃薯抗性品种筛选以及制定有效的害虫综合治理策略提供依据。【方法】以目前生产上商业化推广的4个马铃薯品种（夏波蒂、龙薯4号、龙薯12号、克新17号）块茎为试验材料,采用年龄-阶段特定两性生命表,测定不同品种块茎上马铃薯块茎蛾的发育历期和种群参数,以评价马铃薯块茎蛾在不同品种上的适应性。【结果】取食不同品种块茎的马铃薯块茎蛾幼虫期、蛹期和雌成虫寿命存在显著差异。其中取食克新17号的马铃薯块茎蛾幼虫期（15.18 d)和蛹期（8.10 d）相较于取食其他3个品种（夏波蒂、龙薯4号、龙薯12号）长,而雌成虫寿命（8.46 d）较短。另外,取食同种品种块茎的马铃薯块茎蛾雄成虫寿命普遍高于雌成虫。取食不同品种块茎的马铃薯块茎蛾单雌产卵量存在显著差异,取食夏波蒂（235.06粒）和龙薯4号（254.48粒）的马铃薯块茎蛾单雌产卵量显著多于取食克新17号（165.71粒）。取食不同品种块茎的马铃薯块茎蛾内禀增长率（r）、周限增长率（λ）、净增殖率（R₀）和平均世代时间（T）等种群参数存在极显著差异。其中取食克新17号的马铃薯块茎蛾的r、λ、R₀值（r=0.108,λ=1.125,R₀=26.513）均显著低于其余3个品种,T值（30.28）显著高于其余3个品种。在幼虫选择性取食试验中,1龄马铃薯块茎蛾幼虫尤为偏好龙薯4号和夏波蒂,对克新17号选择性最低, 并随着龄期的增长,选择性逐渐降低。【结论】马铃薯块茎蛾对不同品种薯块的适应性不同,在夏波蒂和龙薯4号上适应性较好,龙薯12号次之,克新17号种群建立水平最低。在马铃薯块茎蛾危害严重区域,可以考虑选择种植马铃薯块茎蛾适应性较低的品种,作为田间抑制马铃薯块茎蛾种群的一个重要策略。     

作物布局对玉米螟种群发生与危害的影响

【目的】 研究玉米螟发生与作物布局间的关系,为玉米螟的生态防控提供理论依据。【方法】 在新疆喀什地区疏勒县玉米螟典型发生区,用诱蛾量、落卵量、幼虫量、蛹量以及玉米蛀秆率、玉米茎秆和果穗蛀孔数、活虫数等指标,依次评估玉米+棉花(Tr1)、玉米+甜瓜(Tr2)、玉米+小麦(Tr3)邻作模式下玉米螟种群动态与危害。【结果】 不同邻作模式下诱捕器诱蛾量、落卵量、幼虫量、蛹量有一定的差异(P < 0.005);其中,Tr1邻作田诱蛾量(越冬代、1代和2代)、落卵量、幼虫量和蛹量显著高于Tr2和Tr3邻作田(P < 0.005),Tr2邻作田的诱蛾量、落卵量、幼虫量和蛹量高于Tr3邻作田但差异不显著(P > 0.005);不同邻作模式下玉米螟发生与危害有一定的差异(P < 0.005);Tr1、Tr2、Tr3 3种不同邻作模式下玉米螟蛀秆率均值为18.03%且差异显著(P < 0.005),总蛀孔数、总活虫数由大到小排序依次为Tr1>Tr3>Tr2、Tr1>Tr2>Tr3。【结论】 玉米螟越冬代成虫羽化后更偏好于向玉米+棉花(Tr1)邻作田迁移且1 代和2代成虫以及棉花周围有种植玉米的田,通过作物布局和合理的药剂防治调控玉米螟种群发生与危害。     

喂饲棉蚜对方斑瓢虫生长发育及捕食功能反应的影响

【目的】研究喂饲棉蚜对方斑瓢虫生长发育及捕食功能反应的影响。【方法】以非转基因棉花品种中棉所49号为材料,在室内研究方斑瓢虫Propylaea quatuordecimpunctata取食棉蚜Aphis gossypii的生长发育及捕食功能反应。【结果】方斑瓢虫1龄平均龄期为1.73 d,2龄平均龄期为2.04 d,3龄平均龄期为1.64 d,4龄平均龄期为1.92 d,蛹期为3.09 d。方斑瓢虫各龄幼虫和成虫的捕食功能反应均属于Holling Ⅱ 型圆盘方程,在棉蚜密度相同下,4龄幼虫和成虫取食量远高于低龄幼虫;方斑瓢虫捕食量均随棉蚜密度的增加而增加,当棉蚜密度增加到一定水平,捕食量趋于稳定。方斑瓢虫各龄幼虫、成虫对棉蚜的寻找效应随猎物密度的增加而减少。【结论】方斑瓢虫取食棉蚜的发育历期室温下为7.3 d,蛹期为3.1 d。方斑瓢虫对棉蚜具有良好的控害潜能。     

核蛋白H-NS调控多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒接合转移的分子机制

【目的】以临床分离的多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒为研究对象,探究核蛋白H-NS调控其接合转移的分子机制,为控制IncFⅡ质粒介导的多重耐药基因水平散播提供理论依据。【方法】测定大肠埃希菌ATCC25922及4株重组菌（pBAD25922、F25922、FΔhns和FΔhns/phns）的生长曲线,比较hns对菌株的影响情况;分别以F25922、FΔhns和FΔhns/phns为供体菌,大肠埃希菌J53（耐叠氮钠）为受体菌,进行接合试验,并计算接合频率;采用实时荧光定量PCR检测各重组菌（F25922、FΔhns和FΔhns/phns）中IncFⅡ质粒接合转移相关基因（traM、traJ和traY）的mRNA表达量;构建LacZ融合报告菌株F25922/P_M（P_J/P_Y）、FΔhns/P_M（P_J/P_Y）和FΔhns/phns/P_M（P_J/P_Y）,分别测定不同菌株中3种基因（traM、traJ和traY）启动子P_M、P_J和P_Y的β-半乳糖苷酶活性;构建H-NS蛋白原核表达载体,采用镍离子亲和层析法分离纯化H-NS核蛋白,PCR扩增并纯化3种基因启动子区的DNA序列,利用电泳迁移率变动分析试验（EMSA）探明核蛋白H-NS调控IncFⅡ质粒接合作用的调控方式,预测H-NS与不同启动子的结合位点并用EMSA进行进一步验证。【结果】重组菌F25922和pBAD25922与大肠埃希菌ATCC25922的生长状况无明显差异,说明质粒pBAD和IncFⅡ均不影响宿主菌大肠埃希菌ATCC25922的生长;但是,缺失重组菌FΔhns和缺失回补重组菌FΔhns/phns的生长速度明显低于大肠埃希菌ATCC25922,表明hns的缺失导致菌株的生长适应性变差,但不影响菌株的存活。接合试验结果显示,FΔhns中IncFⅡ质粒的接合频率较对照菌F25922升高了1 279.33倍（P<0.001）,而FΔhns/phns中IncFⅡ质粒的接合频率虽未完全恢复到对照菌株的水平,但也明显低于FΔhns。实时荧光定量PCR结果显示,FΔhns中tra基因（traM、traJ和traY）的mRNA表达量均极显著高于对照菌株（P<0.001）,其中traJ的mRNA表达量最高,为F25922的1 510.14倍,其次为traY和traM,表达量分别为F25922的448.14倍和81.54倍,而回补株FΔhns/phns中不同基因的mRNA表达量均极显著低于FΔhns,与对照菌相类似。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示,缺失报告菌株FΔhns/P_M（P_J/P_Y）中P_M、P_J和P_Y的β-半乳糖苷酶活性分别为5.66,10.45和21.91,均极显著高于对照菌F25922/P_M（P_J/P_Y）的相应启动子（P<0.001）,而回补报告菌株FΔhns/phns/P_M（P_J/P_Y）中P_M、P_J和P_Y的β-半乳糖苷酶活性极显著低于FΔhns/P_M（P_J/P_Y）,且均与对照菌株无明显差异。这些结果均表明hns对IncFⅡ质粒接合转移呈明显的负调控作用。EMSA结果显示,H-NS核蛋白均能明显阻滞3个tra基因启动子DNA的迁移,说明H-NS可直接与tra基因的3个启动子区结合;通过对结合位点的预测和EMSA进一步验证,证实H-NS核蛋白可与3个启动子区的AT富集区结合。【结论】H-NS核蛋白通过直接与IncFⅡ质粒的traM、traJ和traY的启动子区的AT富集区结合,抑制启动子活性,从而导致启动子下游相关转移基因traM、traJ和traY的表达量下降,结果明显抑制IncFⅡ质粒的接合转移。     

nuoB对莓实假单胞菌生理特性及在冷鲜鸡肉中致腐能力的影响

【目的】研究nuoB对莓实假单胞菌菌体特性及其对冷鲜鸡肉致腐能力的影响,为揭示nuoB介导的冷鲜鸡肉腐败机制,开发新型保鲜技术提供理论依据。【方法】通过构建nuoB插入失活突变株,对比野生株和突变株在体外培养条件下的生长曲线、聚集性、泳动性和生物被膜形成能力;以及原位培养条件对冷鲜鸡肉的致腐特征,包括菌落总数、挥发性盐基氮（TVBN）含量、pH和感官评分,探讨nuoB对莓实假单胞菌生理特性和致腐作用的影响。【结果】体外培养条件下,nuoB并未影响莓实假单胞菌的生长能力、聚集性和swarming泳动性,但突变株的swimming泳动性和生物被膜形成能力在培养过程中显著下降。原位条件下,对冷鲜鸡肉致腐能力的评估发现两组样品菌落总数差异不显著,均达到了10 lg CFU·g^-1;突变株组在冷鲜鸡肉储藏期间TVBN均显著低于野生株组,在第4天时才超过国家标准限量15 mg/100 g,培养末期的最大值约为野生株组的1/2;培养前2 d所有样品的pH均处于正常范围内,突变株组的pH从培养第5天开始显著低于野生株组;感官评价结果显示培养第4天时的两组样品均出现了黏液和异味,被判定为腐败,但突变株组样品稍弱于野生株组。【结论】nuoB的破坏没有影响莓实假单胞菌的生长能力,但抑制了菌株的泳动性、生物被膜形成和对冷鲜鸡肉的致腐能力。