肌动蛋白结合蛋白FgAbp1参与禾谷镰孢生长、发育和毒素体形成

【目的】Abp1作为肌动蛋白结合蛋白家族成员之一,在各种真核生物肌动蛋白骨架形成过程中具有核心作用。本研究旨在分析禾谷镰孢（Fusarium graminearum）中肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在生长发育、对新型杀菌剂氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成等生物学过程中的功能。【方法】利用融合PCR和酵母空隙修复技术分别构建FgAbp1基因敲除打靶片段和融合荧光蛋白载体,再通过聚乙二醇介导的原生质体转化的方法获取基因缺失突变体ΔFgAbp1和荧光标记菌株。观察比较野生型PH-1、突变体ΔFgAbp1和回补体ΔFgAbp1-C的菌丝生长、有性生殖以及无性繁殖,并测定基因敲除突变体ΔFgAbp1对杀菌剂氰烯菌酯的敏感性。通过融合绿色荧光蛋白,明确FgAbp1在菌丝中的分布情况;利用透射电子显微镜观察分析FgAbp1对细胞中液泡/囊泡形态的影响。在非产毒环境和诱导产毒条件下,通过双荧光共定位分析FgAbp1在禾谷镰孢毒素体形成过程中的作用。【结果】禾谷镰孢中,FgAbp1主要呈颗粒状定位于近细胞膜处。在MM培养基中,基因敲除突变体ΔFgAbp1的生长速率与野生型相比降低了15%,但在营养丰富的CM中ΔFgAbp1的生长速率却减慢了38%。突变体ΔFgAbp1在无性繁殖以及有性生殖过程中相较野生型没有明显缺陷。然而在0.5 μg·mL^-1氰烯菌酯的作用下,ΔFgAbp1的菌丝生长完全受到抑制,并且分生孢子萌发率显著下降。此外,敲除基因FgAbp1导致细胞中液泡不能正常形成且囊泡增多。在非产毒条件下,FgAbp1与DON毒素合成关键酶Tri1共定位于囊泡中;在诱导产毒条件下,FgAbp1与Tri1则共定位于毒素体中。此外,敲除基因FgAbp1会导致毒素体不能正常形成。【结论】肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在禾谷镰孢营养生长、发育、氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成过程中发挥着重要作用。     

自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的生长和致病

【背景】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麦茎基腐病是我国小麦生产上的新病害。自噬是真核生物中普遍发生的细胞过程,调控多种植物病原真菌的生长发育和侵染,但其在假禾谷镰孢中的作用还不明确。【目的】明确假禾谷镰孢自噬相关基因FpAtg3在该病菌生长和致病中的作用,解析假禾谷镰孢致病机理,为小麦茎基腐病科学防控提供理论依据。【方法】从NCBI数据库中下载主要真菌的Atg3氨基酸序列,利用MEGA5.05构建系统进化树。利用Split-PCR策略构建FpAtg3基因敲除盒,经PEG介导的原生质体转化导入假禾谷镰孢野生型菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性转化子,并经PCR检测获得FpAtg3基因缺失突变体（ΔFpAtg3）。构建pKNTG-FpAtg3重组载体,导入ΔFpAtg3菌株,利用FpAtg3自身启动子启动FpAtg3的转录,以获得FpAtg3缺失突变体的回补菌株。利用假禾谷镰孢营养生长的培养基PDA、CM和MM测定菌丝生长速率和菌落形态;PDA培养基上测定菌丝形态和菌丝融合率;CMC培养液中测定分生孢子的产量及形态;皮氏培养基上测定孢子融合芽管调控的...     

苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白基因鉴定及毒性功能分析

【目的】CAP（Cysteine-rich secretory protein,Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1）超家族蛋白广泛存在于真菌、细菌、动植物等物种,并且参与病原菌的致病过程。本研究旨在鉴定苹果树腐烂病致病菌——苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）的CAP超家族基因并明确CAP超家族基因在病菌致病方面的作用。【方法】通过BLASTP在苹果黑腐皮壳菌全基因组中检索具有CAP保守结构域的基因;利用特异性引物对鉴定到的CAP基因进行PCR扩增和凝胶电泳检测;使用生物信息学软件和在线数据库进行蛋白序列特征和系统发育分析;利用RT-qPCR分析基因在病菌侵染过程中的表达模式;使用特异性引物扩增CAP基因上、下游片段并从PDL2质粒上扩增筛选标记基因;利用Double-joint PCR构建基因敲除盒并通过PEG介导的原生质转化技术进行基因敲除和基因回补;以遗传霉素（G418）抗性为筛选标记并利用4对引物PCR检测获得基因敲除突变体;以潮霉素（HPH）抗性为筛选标记获得基因回补菌株;通过对菌株进行培养皿内生长试验明确基因对病菌营养生长的影响;通过离体苹果枝条接种试验分析该病菌CAP超家族基因的毒性功能。【结果】在苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个具有CAP保守结构域的基因,分别命名为VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c。序列特征分析发现,3个CAP蛋白均包含4个保守区：N端信号肽、N端延伸区（NTE）、CAP保守功能域和C端延伸区（CTE）。系统发育分析显示,3个CAP蛋白聚于不同的进化支,VmPR1a聚于clade2进化支并与粗糙链孢霉（Neurospora crassa）CAP蛋白进化关系较近;VmPR1b聚于clade3且与镰孢菌属（Fusarium spp.）CAP蛋白的进化关系更近;VmPR1c聚于clade1,并且也与粗糙链孢霉的CAP蛋白进化关系较近。RT-qPCR分析结果显示,VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c在病菌侵染早期（6 h和12 h）均显著上调表达。利用PEG遗传转化技术获得VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c敲除突变体（ΔVmPR1a-7/23、ΔVmPR1b-20/31和ΔVmPR1c-26/40）;营养生长观察发现,所有敲除突变体生长表型与野生型菌株03-8均无明显差异;致病力检测发现,ΔVmPR1b-20/31致病力较野生型无明显变化,而ΔVmPR1a-7/23和ΔVmPR1c-26/40致病力较野生型显著下降。将VmPR1a和VmPR1c分别回补至ΔVmPR1a和ΔVmPR1c,回补菌株（VmPR1a/C和VmPR1c/C）致病力恢复至野生型水平。【结论】苹果黑腐皮壳菌中存在3个CAP超家族基因（VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c）,其中VmPR1a和VmPR1c是苹果黑腐皮壳菌重要的毒性因子。     

氧酰基载体蛋白还原酶基因FgOAR1对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响

【背景】禾谷镰孢(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病(Fusarium head blight)的主要病原真菌，侵染后导致作物品质和产量下降，同时产生多种真菌毒素，严重危害粮食生产和人类健康。氧酰基载体蛋白还原酶(3-oxoacyl ACP reductase,OAR1)催化羧酰基载体蛋白还原成氧酰基载体蛋白，在脂肪酸的生物合成过程中具有重要作用。【目的】构建FgOAR1基因缺失突变体，研究其表型、显微结构、孢子产量、有性生殖和致病力等的变化，探究FgOAR1的生物学功能，揭示其对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响，为新型抑菌作用靶点的筛选及小麦赤霉病的防控提供科学依据。【方法】以禾谷镰孢野生型菌株PH-1为材料，应用Split-Marker基因敲除技术，构建FgOAR1基因缺失突变体(ΔFgOAR1),Gap-repair技术获得缺失基因的回补突变体(ΔFgOAR1-C)；将PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株分别接种到常规培养基，观察菌落表型变化并测定脂肪酸含量差异；接种到含刚果红(Congo-Red)、SDS、NaCl和H₂O...     

灰葡萄孢PKA编码基因在病菌生长发育和致病过程中的功能

为明确灰葡萄孢cAMP信号途径中蛋白激酶A的催化亚基基因pka1、pka2和调节亚基基因pkaR在病菌生长、发育和致病过程中的功能,本研究构建了灰葡萄孢pka1、pka2和pkaR基因的RNAi突变体,以野生型菌株BC22为对照,对pka1、pka2和pkaR基因的RNAi突变体的表型和致病力进行分析,发现pka1基因的RNAi突变体的生长速率明显减慢、菌丝细胞变短、分生孢子产量增加、致病力减弱,菌落颜色、形态以及穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别;pka2基因RNAi突变体的菌丝较野生型明显变细,分生孢子产量降低,生长速率、致病力和穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别;pkaR基因RNAi突变体的菌丝变细,生长速率减慢,分生孢子产量降低,致病力减弱,穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别。结果表明:灰葡萄孢pka1基因正调控病菌的生长、菌丝发育和致病力,负调控分生孢子的形成;pka2基因正调控病菌的菌丝发育和分生孢子的形成;pkaR基因正调控病菌的生长、菌丝发育、分生孢子的形成和病菌的致病力。     

假禾谷镰孢细胞凋亡基因FpTatD的鉴定与表达分析

【目的】鉴定和克隆假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)细胞凋亡相关基因FpTatD,分析FpTatD在假禾谷镰孢菌丝、分生孢子和侵染不同时期的表达,为探索细胞凋亡在假禾谷镰孢侵染过程中的功能提供理论依据。【方法】从GenBank获得模式物种已知的TatD氨基酸序列,利用BLASTP的方法在镰孢中鉴定TatD同源蛋白,并构建进化树;分别以假禾谷镰孢的基因组DNA和cDNA为模板,通过PCR方法克隆假禾谷镰孢FpTatD的基因序列和开放阅读框（ORF）序列;利用实时荧光定量PCR方法分析FpTatD在假禾谷镰孢生长、产孢及侵染不同时期的表达;利用转录组测序方法分析FpTatD在假禾谷镰孢与感病小麦和抗病小麦互作中的表达差异。【结果】镰刀菌中有4个保守的TatD同源蛋白,与其他物种的TatD蛋白构建系统进化树,发现TatD在进化上分成两个大的分支,第一个分支的TatD在所有物种中都非常保守,包括镰刀菌的TatD1和TatD2,第二个分支的TatD蛋白属于植物和真菌特有的,包括镰刀菌的TatD3和TatD4;克隆假禾谷镰孢的FpTatD1、FpTatD2、FpTatD3、FpTatD4基因长度分别为993、1 331、1 227、1 176 bp,ORF区长度为993、1 182、1 227、1 176 bp。FpTatD2 5′端包含两段长度为94和55 bp的非编码序列,FpTatD1、FpTatD3和FpTatD4均不含非编码序列。4个FpTatD编码蛋白质的分子量大小分别为36.37、43.13、45.59、44.25 kD。蛋白结构和序列分析显示FpTatD蛋白均具有明显的DNase结构域以及大部分保守的氨基酸位点;实时荧光定量PCR分析显示,FpTatD1和FpTatD2在假禾谷镰孢中的表达量高,且在侵染初期阶段明显诱导表达,尤其是FpTatD1在侵染36 h和3 d时分别上调表达8.8倍和7.6倍;而FpTatD3和FpTatD4表达量非常低,且在不同阶段的表达量无明显变化,说明FpTatD1和FpTatD2在假禾谷镰孢中起主要作用;通过分析假禾谷镰孢与感病小麦国麦301和抗病小麦周麦24互作的转录组数据,与实时荧光定量PCR结果一致,FpTatD1和FpTatD2表达量高,并在侵染阶段上调表达,而且相对于假禾谷镰孢与感病小麦的亲和互作中,其与抗病小麦的非亲和互作中,FpTatD诱导表达倍数更高。【结论】假禾谷镰孢细胞凋亡相关基因FpTatD可能参与病原菌与寄主的互作过程。     

禾谷镰孢核孔蛋白基因FgNup42的功能分析

【目的】核孔蛋白Nup42在真核生物基因表达调控以及mRNA加工运输等生物学过程中发挥着重要作用,本研究旨在分析禾谷镰孢（Fusarium graminearum）中核孔蛋白基因FgNup42在病原菌生长发育、逆境胁迫、致病和产毒等生物学过程中的功能。【方法】通过融合PCR（double-joint PCR）和酵母空隙修复（gap repair）技术分别构建FgNup42基因敲除和回补载体,再利用PEG介导的原生质体转化的方法获得基因敲除突变体ΔFgNup42和回补体ΔFgNup42-C。观察测定基因敲除突变体ΔFgNup42在营养生长、无性繁殖和有性生殖过程中的变化,同时测定突变体ΔFgNup42对渗透、杀菌剂以及细胞壁胁迫因子的敏感性。将突变体ΔFgNup42进行田间麦穗和室内玉米花丝接种试验明确其致病力情况。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测ΔFgNup42的产毒能力,同时利用qRT-PCR比较分析参与单端孢霉烯族毒素生物合成的7个TRI在野生型PH-1和基因敲除突变体ΔFgNup42中的相对表达量。【结果】表型测定发现,基因敲除突变体ΔFgNup42的生长速率只有野生型PH-1的50%,菌落边缘菌丝分枝变多且致密。显微观察分生孢子形成情况,发现敲除突变体ΔFgNup42相较野生型PH-1分生孢子产量降低了85.45%,并且隔膜数在0—2的分生孢子比例明显增多。有性生殖诱导结果显示ΔFgNup42的有性生殖能力增强,较野生型产生了更多的子囊壳。突变体ΔFgNup42对渗透胁迫因子NaCl和KCl,细胞壁胁迫因子刚果红,以及杀菌剂戊唑醇和氰烯菌酯的敏感性减弱。致病力分析发现敲除基因FgNup42后菌体在麦穗和玉米花丝上的致病力严重降低。此外,与野生型相比,ΔFgNup42中毒素DON、3ADON和15ADON的合成量明显减少。【结论】核孔蛋白基因FgNup42在禾谷镰孢生长发育、抵御逆境以及致病和产毒过程中发挥着重要作用。     

猕猴桃细菌性溃疡病菌T3SS关键效应蛋白基因致病功能

目的 由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae,Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病是全球猕猴桃产业最具毁灭性的病害。病原细菌主要通过III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）将多种效应蛋白（T3SS effector,T3SE）注入寄主植物细胞,进而促进病菌侵染和致病。本研究旨在解析Psa基因组中T3SE的信息并对其T3SS和T3SE的致病功能进行系统分析,为溃疡病菌致病机制的研究和防治策略的制定提供依据。方法 利用marker-free同源重组基因敲除技术获得M228菌株的T3SS功能缺陷突变体ΔhrcS和ΔhrcC,观察突变体在寄主上的致病力,同时检测突变体诱导本氏烟产生细胞坏死的情况;随后利用从Pseudomonas-Plant Interaction数据库下载的T3SE数据库,本地BLAST多序列比对构建强、弱致病菌株M228和M227的T3SE库,并对二者的T3SE基因信息进行比对分析;另外,获得M228菌株T3SE单、多效应子突变菌株20株及2株HopR1基因回补菌株（共涉及19个T3SE）,并将各突变体室内有伤接菌猕猴桃枝条,系统评价各突变体致病力变化并进行统计分析。结果 通过对Psa的hrcS和hrcC基因进行突变,证明T3SS是其在寄主上致病以及非寄主上过敏性坏死反应（HR）所必需的。通过数据库同源比对,发现在强毒株系和弱毒株系中有31个T3SE基因具有100%的同源性,选取一些基因进行缺失突变,发现hopM1/avrE1和hopR1是Psa重要的毒性因子,且二者不存在功能冗余。另外,单独敲除avrPto5或avrRpm1均能提高Psa致病力。在缺失A-F-E基因簇和avrPto5的菌株中,敲除hopM1/avrE1和hopR1也分别导致Psa的致病力显著下降;而同时敲除hopM1/avrE1、hopR1、avrPto5和A-F-E基因簇导致病菌完全丧失致病力。结论HopM1/AvrE1与同家族HopR1均为Psa重要致病因子,且独立于其他效应子发挥作用;avrPto5和avrRpm1基因缺失可以增强Psa的致病力。     

棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌（大丽轮枝菌Verticillium dahliae）中一个新基因（VdHP1）的功能,为解析棉花黄萎病菌的致病机制以及棉花黄萎病的防治提供依据。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdHP1全长进行克隆并测序;利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分别对棉花根系诱导不同时间VdHP1的表达量及V592菌株不同组织中VdHP1的表达量进行测定;构建针对VdHP1的敲除载体、互补载体和过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdHP1基因敲除突变体、互补菌株和过表达菌株;以野生型菌株V592为对照,对VdHP1基因敲除突变体及互补菌株的菌落及菌丝形态进行观察,并对微菌核量、产孢量及致病力进行测定;通过RT-qPCR测定其他致病力相关的基因在VdHP1基因敲除突变体及过表达体菌株中的表达情况。【结果】VdHP1全长为862bp,预测编码蛋白含268个氨基酸,与GenBank中已注释的基因没有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系诱导6—12 h时VdHP1表达水平显著上调,表明VdHP1在大丽轮枝菌侵染早期发挥作用。VdHP1在分生孢子中的表达量显著高于在菌丝和微菌核中的表达量,表明VdHP1在大丽轮枝菌不同组织中的表达具有差异性。与野生型菌株V592相比,VdHP1基因敲除突变体产孢量和产孢梗显著减少,菌丝分支呈螺旋状,对棉花的致病力明显下降。与侵染钉形成相关基因（VdCrz1、VdNoxB、VdPls1）、分泌蛋白释放相关基因（VdSep5）及分生孢子产生相关基因（Vdpf、VdSge1、VGB、VdPLP、VdCYC8、VdNLP1、VdNLP2）在VdHP1基因敲除体中的相对表达量显著下调,在过表达菌株中上调;而与黑色素合成相关基因（VdCmr1、VdSho1、VdLAC、VdPKS1）在VdHP1基因敲除突变体中则显著上调,在过表达菌株中下调。【结论】VdHP1与大丽轮枝菌分生孢子和产孢梗的产生有关,参与大丽轮枝菌致病;VdHP1对与侵染钉形成、分泌蛋白释放及分生孢子产生相关基因的表达具有正调控作用,对黑色素合成相关基因的表达具有负调控作用。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

吉林省玉米穗腐病致病镰孢菌的鉴定与部分菌株对杀菌剂的敏感性

【目的】明确吉林省玉米穗腐病主要致病镰孢种群分布及杀菌剂对镰孢菌菌丝生长的抑制效果,为针对性地开展玉米镰孢穗腐病的防治提供依据。【方法】通过组织分离法和分子生物学方法对2020年采自吉林省36个市(县)的149份玉米穗腐病样品进行病原菌分离鉴定，利用禾谷镰孢复合种(Fusarium graminearum species complex,FGSC)毒素合成相关基因特异性引物检测其产生毒素的化学型，对部分禾谷镰孢复合种进行致病力测定；采用菌丝生长速率法测定7种杀菌剂对禾谷镰孢复合种的抑制效果。【结果】分离获得233株镰孢菌，隶属4个镰孢复合种，含9种镰孢菌，包括拟轮枝镰孢(F.verticillioides)、布氏镰孢(F.boothii)、禾谷镰孢(F.graminearum)、层出镰孢(F.proliferatum)、亚洲镰孢(F.asiaticum)、厚垣镰孢(F.chlamydosporum)、藤仓镰孢(F.fujikuroi)、木贼镰孢(F.equiseti)和亚黏团镰孢(F.subglutinans)，分离频率依次为33.05%、26.18%、25.32%、12.45%、0....     

棉花内生细菌YUPP-10及其分泌蛋白CGTase对棉花枯萎病的防治作用及机理

【目的】棉花枯萎病（Fusarium wilt）是棉花种植中较为严重的土传病害之一,主要采用化学方法进行防治,但对环境和人畜安全造成一定影响。生物防治因其专一性强、安全性高的特点,成为防治棉花枯萎病的重要途径。本研究旨在获得一株高效拮抗细菌,并明确其防治机理,为棉花枯萎病生物防治提供技术支持。【方法】前期获得一株能够破坏β-1,4糖苷键的棉花内生蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）YUPP-10,通过平板对峙培养、共培养法和悬滴法分别测试其对棉花枯萎病菌（尖镰孢,Fusarium oxysporum）菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响;利用YUPP-10菌液浸种处理,研究其对棉花生物量的影响;以尖镰孢菌土为基质种植棉花,生长1周后,用LB液体培养基培养的YUPP-10制成不同浓度（分别为1×10⁸、1×10⁷和1×10⁶ cfu/mL）的生防菌剂灌根处理棉苗,于温室中进行棉花枯萎病的防治效果研究;通过Fosmid文库筛选到了YUPP-10关键抑菌物质为环糊精糖基转移酶（CGTase,EC 2.4.1.19）,研究其对尖镰孢菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响;利用拟南芥花序侵染法将其转化拟南芥,获得能够稳定表达CGTase的转基因株系,研究转基因拟南芥对枯萎病的抗性,以及在病原胁迫下部分防御基因的转录。【结果】YUPP-10菌株发酵液对尖镰孢菌丝生长、产孢和孢子萌发具有显著的抑制作用,随着发酵液浓度的升高,对尖镰孢产孢量和孢子萌发的抑制率越高,最高抑制率分别为98.41%和51.65%。低浓度的YUPP-10菌液能促进棉花种子发芽、出苗和地上部分的生长。YUPP-10发酵液灌根处理后,棉苗的病情指数和病株率显著降低,其中,1×10⁷ cfu/mL的YUPP-10发酵液对棉花枯萎病的防治效果最高,达到45.11%。YUPP-10菌株的关键抑菌物质CGTase能够水解羧甲基纤维素和葡甘聚糖,表明其具有破坏β-1,4糖苷键的能力,进而检测了其对尖镰孢的抑制效果,结果表明CGTase对尖镰孢的菌丝生长、产孢和孢子萌发具有显著的抑制作用,对产孢和孢子萌发的最高抑制率分别达到62.63%和30.83%。转CGTase的拟南芥提高了对枯萎病的抗性,过表达CGTase的拟南芥在病原胁迫下部分防御基因的转录水平升高。【结论】蜡状芽孢杆菌YUPP-10菌株能抑制尖镰孢的生长、促进棉花部分生物量指标的增长并控制枯萎病的危害,CGTase能够抑制尖镰孢的生长,转CGTase拟南芥对枯萎病的抗性增强。     

玉米穗腐病致病禾谷镰孢复合种的遗传多样性、致病力与毒素化学型分析

【目的】明确中国玉米穗腐病致病禾谷镰孢复合种（Fusarium graminearum species complex,FGSC）的菌群遗传结构、致病力、毒素化学型及其相互关系,为玉米镰孢穗腐病防控提供参考信息。【方法】从中国玉米主产区采集玉米穗腐病样本,经单孢分离鉴定,选取代表性的禾谷镰孢复合种,利用22对SSR和10对VNTR引物,使用Popgen32、NTsys2.1、STRUCTURE2.3.4群体遗传学研究软件进行数据分析,结合TEF-1α、β-tubulin和RPB2基因测序构建系统发育树,分析7个地理区域禾谷镰孢复合种的遗传多样性,采用花丝通道注射接种法测定各镰孢菌的致病力,利用产毒基因特异性引物进行毒素化学型的检测。【结果】在禾谷镰孢复合种中共检测到等位位点数48个,多态性位点数39个,多态性条带比率为81.25%,每对引物扩增出多态性条带2—4条;禾谷镰孢复合种7个地理群体平均Shannon’s信息指数和Nei’s遗传多样性指数分别为0.41和0.29,7个地理区域遗传相似度集中在0.6677—0.8797,遗传距离为0.1282—0.4039,表明菌群间具有较丰富的遗传多样性。依据Nei’s遗传距离对7个地理种群进行UPGMA聚类分析,可划分为3个类群;STRUCTURE2.3.4群体结构分析表明,禾谷镰孢复合种菌群被分为2个大类群最合适,西北地区绝大部分属于类群A,华中地区和华南地区菌株均属于类群B,东北地区50%以上菌株属于类群B。TEF-1α、β-tubulin和RPB2基因序列分析表明禾谷镰孢复合种由禾谷镰孢（F. graminearum）、亚洲镰孢（F. asiaticum）、布氏镰孢（F. boothii）和南方镰孢（F. meridionale）构成,上述镰孢菌中存在142个单核苷酸多态性位点（SNP）,通过这些差异序列构建的聚类图能清楚显示出各个种内与种间的遗传分化情况,各镰孢种内遗传多样性十分丰富。禾谷镰孢致病力最强,平均发病面积百分比为20.79%;亚洲镰孢、布氏镰孢和南方镰孢的平均发病面积百分比分别为15.79%、11.77% 和 8.12%。统计分析表明,不同镰孢种所引起的穗腐病平均发病面积占比存在显著差异。禾谷镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、NIV和3ADON+15ADON+NIV 4种,以15ADON为主;布氏镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、NIV、3ADON+15ADON和3ADON+15ADON+NIV 5种,以15ADON为主;亚洲镰孢毒素化学型只有3ADON;南方镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、15ADON+NIV 3种,15ADON为优势类型。此外,15ADON、NIV和3ADON毒素类型菌株平均发病面积百分比分别为17.87%、17.20%和12.37%。【结论】我国不同地理区域尤其是相邻区域禾谷镰孢复合种菌群间存在较为频繁的基因交流与交换。本研究中禾谷镰孢复合种的主要毒素化学型为15ADON,致病力由强到弱依次为禾谷镰孢>亚洲镰孢>布氏镰孢>南方镰孢。整体看来,毒素化学型与菌种类型相关性不显著,致病力主要与菌种类型有关。     

广西玉米穗腐病致病镰孢种群构成与毒素化学型分析

目的 明确广西玉米穗腐病致病镰孢的种群构成及毒素化学型,为玉米穗腐病的综合防治、品种的合理布局和抗病育种提供重要指导和理论依据。方法 从广西玉米主产区采集玉米穗腐病样本,经组织分离和单孢纯化共获得138个镰孢菌分离物,分别来自21个县（区）。利用形态学和分子生物学相结合的方法进行镰孢菌种的鉴定,构建TEF-1α系统发育树,利用产毒基因特异性引物进行毒素化学型检测。结果 在138个镰孢菌分离物中,鉴定出10种镰孢菌,包括拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）、层出镰孢（F. proliferatum）、九州镰孢（F. kyushuense）、南方镰孢（F. meridionale）、甘蔗镰孢（F. sacchari）、藤仓镰孢（F. fujikuroi）、亚洲镰孢（F. asiaticum）、轮纹镰孢（F. concentricum）、变红镰孢（F. incarnatum）和禾谷镰孢（F. graminearum）,分离频率依次为50.72%、12.32%、10.87%、8.70%、6.52%、3.62%、3.62%、1.45%、1.45%和0.72%。禾谷镰孢复合种（F. graminearum species complex,FGSC）由南方镰孢、亚洲镰孢和禾谷镰孢3个独立种组成。拟轮枝镰孢为优势致病菌,禾谷镰孢复合种、层出镰孢和九州镰孢为次优势致病菌,而甘蔗镰孢和轮纹镰孢则是国内首次报道为玉米穗腐病致病菌。拟轮枝镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢和藤仓镰孢检测到伏马毒素关键合成基因FUM1的菌株数分别为67、13、5、3,具有潜在的产伏马毒素能力,轮纹镰孢则未检测到FUM1。供试禾谷镰孢复合种、九州镰孢和变红镰孢菌株的毒素化学型有4种：NIV、15-ADON、NIV+15-ADON和DON+15-ADON。8个九州镰孢菌株、2个亚洲镰孢菌株、2个南方镰孢菌株和1个变红镰孢菌株携带NIV毒素化学型;2个南方镰孢菌株携带15-ADON毒素化学型;8个南方镰孢菌株、2个九州镰孢菌株、1个亚洲镰孢菌株和1个变红镰孢菌株携带NIV+15-ADON毒素化学型;只有1个禾谷镰孢菌株携带DON+15-ADON毒素化学型。未检测到3-ADON毒素化学型菌株。结论 拟轮枝镰孢为广西玉米穗腐病优势致病菌,禾谷镰孢复合种、层出镰孢和九州镰孢为次优势致病菌。拟轮枝镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢、藤仓镰孢均检测到FUM1,广西禾谷镰孢复合种的主要毒素化学型为NIV和15-ADON,变红镰孢和部分九州镰孢的主要毒素化学型为NIV。广西玉米穗腐病镰孢菌种群构成与我国温带玉米相关研究结果存在差异,原因可能为镰孢菌种群适应广西热带和亚热带高温、高湿的玉米生长环境并因此导致毒素化学型的不同。     

化学防控玉米蛀穗害虫对减轻拟轮枝镰孢穗腐病及伏马毒素的作用

【背景】拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）引起的穗腐病严重影响玉米产量和品质,其产生的伏马毒素威胁食品安全。亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和桃蛀螟（Conogethes punctiferalis）等穗期害虫危害可导致玉米严重减产,并加重玉米穗腐病的发生。【目的】评估2种杀虫剂（甲维盐和氯虫苯甲酰胺）、3种杀菌剂（氰烯菌酯、戊唑醇和苯醚甲环唑）对玉米穗期病虫害的防治效果以及对玉米产量和籽粒中伏马毒素含量的影响;明确施用杀虫剂后接菌对穗腐病发病的影响,探究防治玉米穗期病虫害的有效方案,为玉米安全生产提供技术支撑。【方法】以郑单958为供试玉米,在2019年春、夏两季于河北廊坊进行田间试验。玉米大量吐丝后5 d和20 d两次施药,接菌处理于吐丝后7 d进行。在玉米完熟期调查虫害级别、穗腐病发病率和病情指数、果穗穗长、行粒数、穗重和百粒重,计算防治效果和增产情况,并用高效液相色谱-串联质谱法分析籽粒中伏马毒素B1、B2的含量。【结果】与对照相比,施用甲维盐和氯虫苯甲酰胺均可显著降低平均虫害级别、穗腐病发病率、病情指数、伏马毒素含量。与单独施用杀虫剂相比,施用杀虫剂与杀菌剂的混剂未显著降低平均虫害级别、穗腐病发病率、病情指数、伏马毒素含量,也未显著提高产量和对上述病虫害的防治效果。与仅接菌的处理相比,施用氯虫苯甲酰胺后接菌处理在穗腐病发病率、病情指数和伏马毒素含量方面均显著下降。在春玉米和夏玉米试验中,25 g·hm^-2氯虫苯甲酰胺及其与杀菌剂的混剂对穗部螟虫的防治效果分别达82.1%—92.7%、94.2%—95.0%,而30 g·hm^-2甲维盐及其与杀菌剂的混剂对穗部螟虫的防治效果显著低于25 g·hm^-2氯虫苯甲酰胺,仅为57.8%—78.0%、83.1%—89.9%。2种杀虫剂对穗腐病的防治效果无显著差异,春玉米防治效果均>60%,夏玉米防治效果均>88%。对于产量而言,各处理均对果穗穗长和行粒数无显著影响,药剂处理后的果穗穗重均显著高于对照,且各处理间无显著差异。施用杀虫剂后接菌对产量无显著影响。分别施用2种杀虫剂单剂或其与杀菌剂的混剂后,春玉米可增产5.49%—13.49%,夏玉米可增产9.20%—13.95%,玉米籽粒中伏马毒素含量均低于500 μg·kg^-1,而对照玉米中伏马毒素含量达2 817 μg·kg ^-1。喷雾接菌处理的玉米中伏马毒素含量高达8 710 μg·kg ^-1,而接菌前施用杀虫剂可将伏马毒素含量降至1 500 μg·kg ^-1以下。【结论】施用25 g·hm^-2氯虫苯甲酰胺和30 g·hm^-2甲维盐均可通过显著降低玉米蛀穗害虫的危害,从而减轻穗腐病的发生并降低籽粒中伏马毒素含量,提高玉米产量和品质,而杀虫剂/杀菌剂混用与杀虫剂单用对虫害防控效果差异不显著;穗期害虫对果穗的伤害在穗腐病的发生过程中起决定性作用。综合各方面因素,25 g·hm^-2的氯虫苯甲酰胺是防治穗期玉米害虫、减轻穗腐病较为理想的药剂。