猕猴桃溃疡病菌biovar 3群体MLVA分型技术的建立与应用

 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种生物型3(Pseudomonas syringae pv. actinidiae biovar 3,Psa3)是猕猴桃溃疡病菌的世界流行群体,但仅在中国存在复杂的遗传多样性。开发适于Psa3群体分型的MLVA(multilocus variable-number tandem-repeat analysis)技术是探索中国Psa3起源与流行学特性的基础。本研究对7个Psa3菌株进行了全基因组测序,结合已公布的86个全基因组数据,进行比较分析发现,中国Psa3至少存在7个亚群;在各亚群间存在多态性的24个串联重复序列中,其中10个可以通过琼脂糖凝胶电泳区分开且变异指数合适,据此建立了适于Psa3的MLVA技术。采用该技术对分别来自贵州和陕西的62和9个Psa3菌株进行群体分型,分型结果与全基因组分析高度一致,证明该MLVA体系分型准确。MLVA分型结果表明:贵州主产区修文县Psa3有3个MLVA群体,其中亚群4的组内分化明显,代表最早发生的群体;而亚群 1和3的结构单一,且多在新果园发现,是新传入群体。总之,本研究建立了一套可用于Psa3群体分型的MLVA技术,将有助于解析中国各猕猴桃产区Psa3群体结构,以及探索中国Psa3的起源、传播和流行学特征。     

猕猴桃溃疡病菌biovar 3群体MLVA分型技术的建立与应用

 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种生物型3(Pseudomonas syringae pv. actinidiae biovar 3,Psa3)是猕猴桃溃疡病菌的世界流行群体,但仅在中国存在复杂的遗传多样性。开发适于Psa3群体分型的MLVA(multilocus variable-number tandem-repeat analysis)技术是探索中国Psa3起源与流行学特性的基础。本研究对7个Psa3菌株进行了全基因组测序,结合已公布的86个全基因组数据,进行比较分析发现,中国Psa3至少存在7个亚群;在各亚群间存在多态性的24个串联重复序列中,其中10个可以通过琼脂糖凝胶电泳区分开且变异指数合适,据此建立了适于Psa3的MLVA技术。采用该技术对分别来自贵州和陕西的62和9个Psa3菌株进行群体分型,分型结果与全基因组分析高度一致,证明该MLVA体系分型准确。MLVA分型结果表明:贵州主产区修文县Psa3有3个MLVA群体,其中亚群4的组内分化明显,代表最早发生的群体;而亚群 1和3的结构单一,且多在新果园发现,是新传入群体。总之,本研究建立了一套可用于Psa3群体分型的MLVA技术,将有助于解析中国各猕猴桃产区Psa3群体结构,以及探索中国Psa3的起源、传播和流行学特征。     

GFPuv标记猕猴桃溃疡病菌的生物学特性 及其在土壤、根系中的定殖

【目的】获得具有荧光标记的猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）菌株,为进一步揭示其侵染致病过程奠定基础。【方法】电击法对病菌进行GFPuv基因标记,应用荧光显微镜和平板稀释法研究标记菌株在土壤和根部的定殖情况。【结果】GFPuv标记的猕猴桃溃疡病菌菌株在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光,8株标记菌基因组DNA中均扩增出约700 bp的目的片段。标记菌株PSAmx7-GFPuv1的菌体形态、生长曲线、最适温度、最适pH、致病性均与野生型无显著差异,其绿色荧光可稳定遗传。标记菌在灭菌土壤中可存活3个月左右,在未灭菌土壤中也能存活3周;灌根1 d检测,根表、根内组织中可分离到目标菌落,随后标记菌株数量呈现“先增后降”的趋势。【结论】电击法成功地将GFPuv基因转入猕猴桃溃疡病菌;导入的GFPuv 基因对宿主菌的生物学特性没有影响;标记菌可在灭菌土壤中长期存活,并在根部定殖和增殖。     

陕西猕猴桃细菌性溃疡病田间发生动态和规律

为有效防治猕猴桃细菌性溃疡病和明确其发生时期与规律,采用田间定点、定期系统调查的方法,对该病害在枝干和叶片上的周年发生动态、不同品种的发病情况和发病部位,以及影响发病的气候因素等进行了研究.结果显示,溃疡病在枝干上有冬末春初和秋季2个发病高峰,以冬末春初为主,发病株率占全年的80％以上;在叶片上亦有2个发病高峰,分别为春末夏初和秋末冬初.溃疡病在不同品种上的发病存在明显差异,以红阳品种发病率较高,平均病株率达37.8％,平均病叶率达21％;不同品种的主干、侧枝、结果枝均能发病,但发病率有明显差异(P＜0.05),以侧枝和结果枝发病为主;菌脓出现位点在枝干皮孔、芽眼、伤口、枝杈裂缝及落叶痕等处,以皮孔为主要出脓位点;低温有利于枝干发病,其中秋冬季日均温低于0℃的时间和出现早晚是影响枝干发病的重要因素.     

猕猴桃溃疡病菌不致病菌株G230的鉴定及形成原因分析

为探索田间猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae(Psa)致病力丧失的分子机制,针对从猕猴桃果园中分离获得的1株不致病菌株G230,通过特异性引物检测和多基因序列分析明确其分类地位,并设计引物检测其是否由已知遗传变异引起,通过比较基因组学、基因表达、超敏反应和荧光素酶报告菌株检测确定引起菌株G230致病力丧失的原因。结果表明,不致病菌株G230为Psa生物型3(Psa3),其致病缺陷不是由已报道的遗传变异引起;基于基因组比较分析发现菌株G230中的hrpS基因被转座子ISPsy36插入破坏,导致Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）不能正常表达;而在不致病菌株G230中表达hrpS基因后能恢复其T3SS功能,使其具备致病能力及激发非寄主超敏反应的能力。表明转座子ISPsy36插入hrpS基因内部可以破坏Psa的T3SS功能进而使其丧失致病力,这是自然条件下Psa3丧失致病力的一种新型机制。     

贵州省黑皮鸡枞蛛网病病原菌的鉴定及其生物学特性分析和防控药剂筛选

为明确贵州省黑皮鸡枞蛛网病病原菌的分类地位、生物学特性及其有效防控药剂,分别从贵州省黄平县、贞丰县和剑河县采集典型发病黑皮鸡枞样品,并对其致病菌进行分离,通过致病性测定、形态学鉴定和多基因（ITS、TEF-1α、RPB1、RPB2）序列分析对疑似病原菌进行鉴定,并对其主要生物学特性进行测定,采用菌丝生长速率法分析22种药剂对病原菌的抑制效果。结果显示,通过柯赫氏法则验证分离物2020010406为黑皮鸡枞蛛网病病原菌,并结合形态学特征和多基因系统发育分析结果将其鉴定为Cladobotryum asterophorum;该病原菌菌丝体生长的最适温度为30℃,最适pH为6,可溶性淀粉和酵母粉分别为其最适碳、氮源;在供试10种化学药剂中,丙环唑、咪鲜胺锰盐和三唑酮的抑菌效果较好,EC₅₀分别为0.816、3.974和4.604 μg/mL;供试12种生物源药剂中,丁子香酚和蛇床子素的抑菌效果最为突出,EC₅₀分别为0.000 2 μg/mL和0.006 μg/mL,表明生物源药剂对黑皮鸡枞蛛网病的防控效果好,且毒性低,具有较好的应用潜力。     

叶面施钙对猕猴桃钙含量、品质及贮藏性的影响

为提高猕猴桃营养价值,改善果实品质和贮藏性。以“贵长”猕猴桃为试验材料,采收前对叶面喷施不同钙,比较不同处理果实钙含量、品质及贮藏性指标。结果表明,叶面施钙能提高猕猴桃果实钙含量,提升猕猴桃综合品质,其中Ca(NO3)2 处理的猕猴桃平均单果重、果形指数和维生素C均大于其它处理,分别达87.49g、 1.72和213.54mg/100g;叶面喷施Ca(C6H11O7)2 的果实糖酸比达11.42;叶面施钙能降低猕猴桃维生素C和可滴定酸含量的下降速度,推迟可溶性固形物和可溶性总糖含量的峰值期,延缓猕猴桃软化。试验表明,叶面施钙能提高猕猴桃营养价值,提高品质和贮藏性,提升商品性。     

城镇化对绿色发展绩效的门槛效应研究——以大西北、黄河中游两大经济区城市为例

探究城镇化对生态脆弱、环境敏感的大西北和黄河中游两大综合经济区绿色发展绩效的影响,对于实现全国绿色发展战略目标有着决定性意义。文中创新性地选取大西北和黄河中游经济区62个地级及以上城市2003-2016年数据,运用全局非径向方向性距离函数构建绿色发展绩效指数(GDPI),深刻揭示了该地区绿色发展状况。进一步地,为克服已有文献使用线性模型研究的局限性,文中选取城镇化率作为门槛变量,运用基于拓展的STIRPAT模型的面板门槛回归,更为准确地刻画了城镇化与绿色发展绩效之间的非线性关系。发现以城镇化率77.3%与93.4%为门槛值,城镇化对绿色发展绩效的影响分为前期消极抑制、中期微弱促进、后期积极促进三个阶段。     

猕猴桃细菌性溃疡病菌T3SS关键效应蛋白基因致病功能

目的 由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae,Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病是全球猕猴桃产业最具毁灭性的病害。病原细菌主要通过III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）将多种效应蛋白（T3SS effector,T3SE）注入寄主植物细胞,进而促进病菌侵染和致病。本研究旨在解析Psa基因组中T3SE的信息并对其T3SS和T3SE的致病功能进行系统分析,为溃疡病菌致病机制的研究和防治策略的制定提供依据。方法 利用marker-free同源重组基因敲除技术获得M228菌株的T3SS功能缺陷突变体ΔhrcS和ΔhrcC,观察突变体在寄主上的致病力,同时检测突变体诱导本氏烟产生细胞坏死的情况;随后利用从Pseudomonas-Plant Interaction数据库下载的T3SE数据库,本地BLAST多序列比对构建强、弱致病菌株M228和M227的T3SE库,并对二者的T3SE基因信息进行比对分析;另外,获得M228菌株T3SE单、多效应子突变菌株20株及2株HopR1基因回补菌株（共涉及19个T3SE）,并将各突变体室内有伤接菌猕猴桃枝条,系统评价各突变体致病力变化并进行统计分析。结果 通过对Psa的hrcS和hrcC基因进行突变,证明T3SS是其在寄主上致病以及非寄主上过敏性坏死反应（HR）所必需的。通过数据库同源比对,发现在强毒株系和弱毒株系中有31个T3SE基因具有100%的同源性,选取一些基因进行缺失突变,发现hopM1/avrE1和hopR1是Psa重要的毒性因子,且二者不存在功能冗余。另外,单独敲除avrPto5或avrRpm1均能提高Psa致病力。在缺失A-F-E基因簇和avrPto5的菌株中,敲除hopM1/avrE1和hopR1也分别导致Psa的致病力显著下降;而同时敲除hopM1/avrE1、hopR1、avrPto5和A-F-E基因簇导致病菌完全丧失致病力。结论HopM1/AvrE1与同家族HopR1均为Psa重要致病因子,且独立于其他效应子发挥作用;avrPto5和avrRpm1基因缺失可以增强Psa的致病力。