水稻直立短穗突变体esp的转录组研究

【目的】克隆水稻直立短穗基因Erect and Short Panicle(ESP),分析其参与的基因调控途径,解析ESP控制株型、穗长等农艺性状的分子机理。【方法】以直立短穗突变体esp及其野生型为材料,成熟期进行株高、穗长、粒长等表型测定;构建籼粳杂交F2定位群体,挑选与突变表型一致的F2单株,利用与突变性状连锁的分子标记对目的基因进行定位;对野生型和突变体进行基因组测序,结合定位结果,找到突变位点,克隆ESP;利用生物信息学软件进行进化树和基因表达分析;提取野生型和突变体幼穗中的RNA并建库,GO(gene ontology)聚类分析表达差异基因,同时根据KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库,分析野生型和突变体中植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因的表达变化,并通过qRT-PCR验证。【结果】通过表型观察和农艺性状调查,与野生型相比,直立短穗突变体esp株高降低,穗长变短,穗型由弯曲变为直立,每穗粒数减少,粒长变短,粒宽和千粒重增加;有效穗数无显著差异。利用突变体esp与PA64构建籼粳F2定位群体,将目的基因定位于水稻第7染色体长臂标记C7-11和C7-14之间7.58 Mb区间内,基因组测序发现LOC_Os07g42410第6内含子与第7外显子连接位点由碱基G变异为A,导致第6内含子不能被剪切,蛋白翻译提前终止;该基因与已报道的OsDEP2/OsEP2为等位基因。进化分析显示该基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中;表达分析表明ESP在茎秆、花序、雌蕊、内外稃和子房中高度表达,其表达水平随着子房变大而逐渐降低。利用转录组分析突变体和野生型幼穗中的基因表达,结果表明,与野生型相比,esp突变体中表达差异显著(差异1.5倍)的基因630个,其中235个表达上调,395个表达下调。GO分析显示植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因受到不同程度地调控,利用qRT-PCR进行验证,结果与转录组数据一致。【结论】直立短穗基因ESP与已报道的直立穗基因OsDEP2/OsEP2为等位基因,其突变导致株高降低、穗长变短等多个表型;ESP可能通过调节植物激素信号转导、内质网蛋白加工过程中的基因表达,进而影响植株的发育。     

水稻根系发育基因OsKSR7 的克隆与功能分析

【目的】 水稻根系是与地上部性状和产量密切相关的重要农艺性状。通过鉴定新的水稻根系发育相关基因,为深入解析水稻根系发育遗传机理奠定基础。【方法】 从甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变的水稻Kasalath突变体库中筛选到1个根系发育缺陷的突变体Osksr7 （Oryza sativa kasalath short root 7 ）。通过溶液培养和田间种植,对该突变体进行苗期表型鉴定及成熟期主要农艺性状考察。将Osksr7 分别与野生型籼稻Kasalath和粳稻Nipponbare杂交,F₂群体进行遗传分析和突变基因的图位克隆,对预测的候选基因进行测序验证。构建由35S启动子驱动OsKSR7 的回复载体,通过农杆菌介导转入突变体成熟胚诱导的愈伤组织进行转基因互补验证。【结果】 与野生型相比,Osksr7 幼苗期的主根、不定根、侧根和根毛的伸长都受到抑制,主根、不定根和侧根的长度分别只有野生型的33%、38.9%和35.3%,但不定根数有显著增加。农艺性状调查发现,Osksr7 的株高、穗数、茎秆粗细、结实率、千粒重和剑叶长宽等性状都受到显著影响,其中,穗数和结实率的差异极显著,分别只有野生型的56.3%和37.3%。遗传分析表明,突变体Osksr7 和籼稻Kasalath杂交的F₁表型正常,F₂群体中正常植株与短根突变植株的分离比符合3﹕1,表明突变体Osksr7 的突变性状受1对隐性核基因控制;利用SSR和InDel分子标记将突变基因定位在水稻第11染色体上IND1与IND2之间,物理距离约为143 kb的区间。在该区间有25个预测注释基因,候选基因测序比对发现,突变体Osksr7 中的一个编码转运蛋白的基因LOC_Os11g24560 第一个外显子上ATG后73 bp处的T突变为A,导致编码的第25位氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。生物信息学分析表明LOC_Os11g24560 是介导蛋白质从内质网（ER）运向高尔基体（Golgi）的COPII有被小泡的SEC23亚基在水稻中的同源基因。RT-PCR表明LOC_Os11g24560 的表达水平在野生型和Osksr7 突变体中无显著差异,35S启动子驱动的LOC_Os11g24560 的回复载体能够使Osksr7 突变体的表型回复成野生型,证实Osksr7 的表型是由LOC_Os11g24560 突变引起。【结论】 Osksr7 是一个水稻短根突变体,其产量相关的几个重要农艺性状显著受抑制,突变基因为LOC_Os11g24560 ,编码COPII有被小泡的SEC23亚基,与已报道的水稻根系基因都不等位,是一个新的水稻根系发育调控基因。     

水稻黄绿叶突变体ygl13的鉴定及候选基因分析

【目的】对水稻黄绿叶突变体ygl13 (yellow-green leaf 13 )进行表型鉴定和候选基因检测,以便了解水稻叶色形成和调控的分子机制。【方法】经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变籼稻恢复系缙恢10号（Jinhui 10）,从中筛选出1份遗传稳定的黄绿叶突变体命名为ygl13,对突变体的表型进行系统观察,调查其成熟期的主要农艺性状,分别测定野生型和突变体苗期和孕穗期的叶片光合色素含量,同时利用透射电镜观察野生型和突变体ygl13的叶肉细胞及叶绿体结构。将表型正常的不育系西农1A与突变体ygl13杂交,根据F₁和F₂群体的性状表现与分离情况,分析该突变性状的遗传行为,并以F₂作为基因定位群体,对突变体ygl13进行候选基因遴选和突变位点测序验证。【结果】突变体ygl13的植株叶片在整个生育期均呈现黄绿色,与野生型缙恢10号相比,突变体ygl13苗期和孕穗期叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均极显著降低。透射电镜观察结果显示,与野生型相比,突变体ygl13叶绿体结构异常,基质片层减少退化,类囊体片层减少,不规则的散乱分布。农艺性状调查结果表明,突变体ygl13穗总粒数增加了26.06%,株高和结实率分别降低了12.33%和18.82%,但穗长、有效穗、穗实粒数和千粒重无显著差异。F₂群体正常叶色的植株数与黄绿叶植株数分离比经χ²测验符合3﹕1分离比例（χ²=2.35＜χ²_0.05=3.84）,表明ygl13的黄绿叶性状由1对隐性核基因控制。YGL13被定位于第8染色体短臂InDel标记ID43和ID69之间,遗传距离分别为4.0和0.5 cM,区间物理距离约为318 kb,共有52个基因。经测序比对分析发现,ygl13突变体在OsSIG1编码区的第1 005个碱基G突变为碱基A（位于第三外显子）,造成编码色氨酸（Trp或W）的密码子突变为终止密码子,导致蛋白翻译提前终止,则该基因编码520个氨基酸的蛋白质突变为334个氨基酸的截短蛋白。qRT-PCR结果表明,突变体ygl13部分光合色素代谢途径和光系统相关基因表达紊乱。【结论】水稻突变体ygl13的黄绿叶性状由1对隐性核基因控制,该基因与已报道的水稻质体σ因子OsSIG1为等位基因。     

水稻粒宽突变体gw87的基因定位及候选基因分析

【目的】对水稻粒宽突变体gw87（grain width 87）进行表型鉴定、遗传分析、基因定位及候选基因分析,为探明该基因调控水稻籽粒大小的分子机制及应用潜力奠定基础。【方法】利用甲基磺酸乙酯诱变籼稻恢复系材料676R,获得一份籽粒宽度和千粒重显著增加的突变体gw87。对该突变体进行表型观察、农艺性状调查及外源油菜素内酯（BL）敏感性、叶绿素含量、光合参数测定,了解其表型特征及生理特性。调查gw87与676R杂交F₁的表型和F₂群体的分离情况,分析其遗传行为;选取该群体中的突变植株进行高通量测序,并利用gw87与粳稻品种日本晴杂交的F₂代作为定位群体,通过MutMap分析和分子标记定位,遴选候选基因并进行DNA和cDNA测序验证。利用qRT-PCR分析gw87和676R中BR合成途径基因OsDWARF4、D11和D2的表达差异。【结果】与野生型亲本676R相比,gw87突变体的株高降低,节间缩短,其中,倒一节间长度缩短最大,并呈现出扭曲的形态;叶片长度减少,宽度增加;单株有效穗数、主穗穗长和结实率显著降低,但籽粒宽度和千粒重显著增大。BL敏感性试验显示,gw87突变体幼苗对外源BL的敏感性降低。光合色素和光合参数测定表明,gw87光合色素含量增加,光合速率也有所增加。遗传分析表明gw87的突变性状是由1对隐性核基因控制。MutMap分析显示gw87突变基因位于第5染色体中部,在该染色体区域仅有1个碱基突变引起编码氨基酸变化;分子标记连锁分析表明该突变基因位于InDel标记X2和X3之间约101 kb的染色体区域;综合这两方面分析结果,最后遴选出gw87候选基因是编码一个含有AP2/EREBP DNA绑定结构域的转录因子基因LOC_Os05g32270。对该候选基因进行DNA和cDNA测序验证,发现gw87突变体中该基因DNA的第1 041位的碱基由G突变为A,导致与该位点相邻的76 bp内含子序列被剪接为外显子,引起阅读框移码,蛋白翻译提前终止。qRT-PCR分析显示gw87突变体中BR合成途径基因的表达量显著上调,表明gw87突变体中BR信号减弱。【结论】gw87是smos1、shb、rla1、ngr5的新等位突变体,但与这些突变体表型不同,gw87籽粒的宽度和千粒重显著增加,可能是LOC_Os05g32270的突变位点不同,导致其编码蛋白的功能活性不同所造成。     

水稻穗顶端退化突变体paa21的表型分析及基因克隆

【目的】水稻穗顶端退化严重影响产量,鉴定与克隆水稻穗顶端退化相关基因,可以丰富水稻穗发育调控的分子机理,为水稻高产分子设计育种提供理论基础和基因资源。【方法】从粳稻品种武运粳30号EMS突变体库筛选到一份稳定遗传的穗顶端退化突变体panicle apical abortion 21（paa21）。对退化一次枝梗比例、每穗退化粒数占比、每穗粒数、株高、穗长、单株产量等农艺性状进行统计。使用台盼蓝和伊文思蓝染色检测顶端小穗是否发生程序性细胞死亡。测定WT和paa21不同发育时期幼穗和不同穗部位的H₂O₂含量。paa21分别与籼稻II-32B、9311正反交进行遗传分析。利用paa21与籼稻II-32B杂交构建的F₂群体进行基因定位和克隆。使用SWISS-MODEL网站预测野生型和突变体蛋白的三维结构。利用RT-qPCR分析ROS响应标志基因、程序性细胞死亡相关基因、过氧化氢酶相关基因的表达量。【结果】paa21突变体发生严重的穗顶端退化,统计paa21所有一次枝梗退化情况,发现退化小穗主要位于顶端的一次枝梗上。与WT相比,paa21的株高、每穗粒数、穗长和单株产量均降低。通过观察不同发育时期的幼穗,发现在paa21突变体幼穗发育至12 cm时,可见穗顶端退化表型。台盼蓝和伊文思蓝染色结果表明突变体顶端小穗发生程序性细胞死亡。在退化的paa21顶端小穗中观察到更强烈的DAB染色;H₂O₂含量测定结果表明,与WT相比,paa21穗中积累更高水平的ROS。遗传分析表明paa21突变表型受一对隐性核基因控制。图位克隆结果发现paa21中Os02g0673100第二外显子发生一个C到T的突变,导致丙氨酸突变为缬氨酸。该基因编码一个铝激活的苹果酸转运蛋白ALMT7。突变位点位于第4个跨膜螺旋上。SWISS-MODEL预测结果表明,该突变位点并未对突变体蛋白三维结构造成明显影响。RT-qPCR结果表明,在幼穗发育至10 cm时,paa21中ROS响应标志基因Os01g0826400、Os05g0474800和Os02g0181300,程序性细胞死亡相关基因VPE2和VPE3,过氧化氢酶编码基因CATA、CATB、CATC的表达量较WT大幅升高。此外,paa21 10 cm幼穗中过氧化氢酶（CAT）的活性较WT明显下降。【结论】paa21幼穗在发育后期顶端小穗中积累过量的ROS,产生程序性细胞死亡,最终导致顶端小穗发生退化。     

水稻短宽粒基因SWG1的图位克隆

【目的】水稻产量由单位面积有效穗数、每穗粒数和粒重3个因素构成,其中,粒重主要由水稻的籽粒形态决定。筛选和鉴定新的粒型突变材料和基因,可为产量性状的分子设计育种奠定基础。【方法】在籼稻保持系西大1B(XD1B)的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变群体中鉴定到一个短宽粒突变体short and widen grain 1(swg1);分析籽粒形态和其他农艺性状,并对颖壳进行组织细胞学观察分析;运用BSA法进行基因定位;通过遗传互补试验确定候选基因;采用qRT-PCR分析该基因的表达模式及其他粒型相关基因和细胞发育基因的表达水平。【结果】农艺性状分析发现,与野生型相比,swg1突变体粒长显著降低,粒宽显著增加,表现出短宽粒的表型;进一步组织和细胞学分析,发现突变体颖壳纵向细胞变短是粒长变短的主要原因,而粒宽增加是由于颖壳横向细胞数目和细胞大小同时增加。遗传分析结果表明,该突变性状受隐性单基因控制,通过图位克隆与遗传互补验证,确定候选基因为LOC＿Os07g42410,编码一个植物特异转录因子。qRT-PCR分析发现该基因表达无明显的组织特异性,在茎、叶、幼穗中表达强烈。通过对已知粒型相关基因、细胞...     

水稻开颖半不育突变体的观察、遗传分析和基因定位

【目的】通过对一份航天诱变水稻（Oryza sativa L.）开颖半不育突变体ohss（open-hull semi-sterility）进行形态特性调查、遗传分析和基因定位,筛选候选基因,为下一步基因克隆和功能分析奠定基础。【方法】以籼稻品种航恢七号为材料,通过“神舟八号”飞船搭载,诱变获得一份水稻开颖半不育突变体ohss。对其进行形态特征解剖观察,分析颖花器官发育突变特点。调查突变体和野生型的花粉可育率、自然结实率和套袋自交结实率,对其育性进行鉴定。随机选取5个成熟单株,考察穗部谷粒相关性状并进行统计分析。通过覆盖全基因组的SSR分子标记检测,解析空间诱变的分子变异效应。以航恢七号、Francis和02428与突变体ohss配制杂交组合,观察F₁和F₂植株的花器官表型,进行?²测验,对突变性状进行遗传分析。以02428/ohss的F₂分离群体作为目标基因定位群体,同时利用SSR标记以及新开发的多个InDel分子标记开展基因定位研究。利用RAP水稻基因组注释数据库对定位区间的候选基因进行预测,通过序列比对和基因表达分析筛选候选基因。【结果】开颖半不育花器官突变体ohss与野生型相比,抽穗期穗部明显包茎,颖花发育出现异常,内外稃片瘪弱、扭曲变形且开裂不抱合,颖花内部发育类似内稃状的器官,部分颖花没有内稃的分化。ohss发育异常颖花中可育花粉率58.74%,导致单株结实率、穗重、穗实粒数与野生型相比极显著降低。全基因组SSR标记检测表明突变体ohss总变异频率为0.0336,除了第7、12染色体未检测到突变位点,其他染色体上检测到突变频率范围为0.0143-0.0889。遗传分析结果显示ohss的开颖半不育表型受单隐性核基因ohss(t)控制,并将ohss(t)定位在水稻第3染色体上2个InDel标记InDel6043和InDel6070之间约27.6 kb的物理距离内。该区域有3个预测注释基因,序列比对和表达分析表明突变体ohss的OsMADS1编码区及启动子序列未发生突变,但是表达模式发生强烈改变。【结论】开颖半不育的花器官发育突变体ohss受单隐性核基因ohss(t)控制,ohss(t)定位在水稻第3染色体上InDel6043和InDel6070标记之间约27.6 kb的物理距离内,其OsMADS1的编码序列及5′UTR区未发生碱基突变但表达受到强烈抑制。     

谷子穗顶端败育突变体sipaa1的表型分析和基因定位

【目的】穗发育对于农作物产量至关重要,而穗顶端败育谷子产量下降的重要原因之一。通过挖掘谷子穗顶端败育的相关基因,探求谷子穗顶端发育的生物学通路,以期为谷子穗发育遗传机理研究提供理论基础。【方法】利用化学诱变剂甲基硫酸乙酯（ethyl methyl sulfonate,EMS）对野生型豫谷一号（Yugu1）进行诱变,在其后代中发现了一个可以稳定遗传的穗顶端败育的突变体,命名为sipaa1,同时对该突变体的农艺性状进行鉴定。以突变体sipaa1母本,SSR41父本构建的F₂定位群体为材料进行遗传分析及图位克隆,确定基因所属染色体以及在该染色体上的位置。对突变体sipaa1和野生型Yugu1的BC₁F₂进行高通量测序,挖掘定位区间内的候选基因,根据候选基因在谷子不同组织部位表达量的差异,找出在穗部高表达的候选基因。对孕穗期的Yugu1和sipaa1进行转录组测序,寻找差异表达基因并分析差异表达基因富集的生物学通路。【结果】与Yugu1相比,突变体sipaa1的平均株高略有增高,增幅不显著,叶长、叶宽分别降低了10.66%和5.08%。突变体的表型变异主要集中在穗部,最突出的表现是穗顶端小花发育异常,谷穗长和谷穗粗分别降低了11.36%和16.12%,单株穗重、谷码数、单穗粒重及千粒重分别降低了30.02%、32.58%、30.55%和18.18%。通过对sipaa1×SSR41的F₂代群体中正常株与突变株的遗传分析表明该突变为隐性单基因控制。经图位克隆将突变基因定位于第1染色体Indel标记1-9.23与1-9.333之间约100 kb的范围内。结合高通量测序数据库,在该定位区间筛选到6个在穗部高表达的候选基因。转录组测序发现,在突变体与野生型之间存在2 768个上调表达基因,507个下调表达基因,且定位区间内有2个差异表达基因主要与激素信号转导、外界胁迫响应、植物-病原互作等生物学通路有关。【结论】谷子穗顶端败育突变体sipaa1由隐性单基因控制,突变基因位于第1染色体Indel标记1-9.23与1-9.333之间,转录组测序与基因功能分析发现了2个在穗部高表达且与植物花器官发育及胁迫响应密切相关的候选基因,候选基因可能通过对激素、胁迫响应,以及细胞程序性死亡等相关通路调控谷子穗顶端败育。     

水稻短穗小粒突变体sps1的鉴定与基因精细定位

【目的】通过对一个水稻短穗小粒突变体的鉴定与基因精细定位,为水稻等禾本科作物的籽粒发育及分子改良奠定基础。【方法】在水稻EMS诱变体库中鉴定到一个短穗小粒突变体,暂命名为sps1（shorten panicle and seed 1）。成熟期观察野生型和sps1的形态变化,考察株高、节间长、穗实粒数、结实率和千粒重等农艺性状;对野生型和sps1籽粒外稃内外表皮中部进行扫描电镜观察,并利用石蜡切片进一步分析野生型和sps1籽粒的形态变化;配制缙恢10号/sps1杂交组合进行遗传分析,并利用其F₂群体进行基因精细定位;对野生型和sps1两叶一心期的叶鞘进行油菜素内酯（brassinolide,BR）敏感性试验;抽穗期分析SPS1在水稻根、茎、叶、鞘和穗中的表达,并对籽粒发育相关基因和BR相关基因进行qPCR分析。【结果】sps1穗和倒1、2、3的节间长度均极显著短于野生型,导致株高半矮化;此外,sps1穗枝梗数、结实率和千粒重也显著降低;扫描电镜观察发现sps1外稃中部内外表皮细胞长度极显著小于野生型,宽度则极显著变大,石蜡切片观察进一步证实了sps1籽粒宽短是由细胞变短、变宽造成的;籽粒发育相关基因qPCR分析发现,部分通过调控细胞分裂和扩展进而影响水稻籽粒发育的基因表达量发生了显著变化,在sps1中,AFD1、SLG、HGW和GS3的表达量显著上调,GW7和GID1显著下调;选取符合3﹕1分离比例的F₂代分离群体中的突变单株进行基因定位,最终将调控基因精细定位在第7染色体上标记sps1-3和sps1-2之间134 kb的物理范围内,包含19个注释基因;经测序,与野生型相比,发现sps1中的Os07g0616000在编码区有一个A-T的碱基替换,致使编码的赖氨酸变成了终止密码子,导致蛋白翻译提前终止,初步确定为候选基因。qPCR分析发现SPS1在水稻的根、茎、叶、鞘和穗中均有表达,且在茎秆中的表达量最高;生物信息学分析发现,SPS1是DEP2的一个新等位基因。sps1对外源BR的敏感性降低,BR钝感基因D1的表达极显著下调;推测SPS1/DEP2可能通过BR信号传导途径调控水稻籽粒和株型的发育。【结论】sps1是一个水稻短穗小粒突变体,SPS1编码一个表达蛋白,是DEP2的新等位基因,通过BR信号传导途径调控水稻籽粒和株型的发育。     

水稻黄绿叶突变体ygl3的鉴定与基因功能分析

【目的】 为了丰富和加深人们对植物叶色形成的分子机理认识,对水稻黄绿叶突变体ygl3（yellow green leaf 3）进行表型鉴定和基因克隆,阐明YGL3的分子功能,为解析YGL3调控水稻叶色形成的分子机理奠定基础。【方法】 从水稻中花11 CRISPR-Cas9敲除突变体库中鉴定出2份稳定遗传的等位黄绿叶突变体,命名为ygl3-1与ygl3-2,对突变体的表型进行鉴定,测定野生型和突变体苗期的叶绿素含量,运用透射电镜观察野生型和突变体ygl3的叶绿体结构。利用实时荧光定量PCR分析YGL3的组织表达模式,并使用BioXM 2.6软件对YGL3及其同源蛋白序列进行比对,采用酵母双杂交方法筛选YGL3的互作蛋白。【结果】 在苗期,与野生型相比,突变体ygl3叶片黄化,叶绿素、类胡萝卜素和总光合色素含量显著降低。透射电镜结果表明,突变体ygl3叶绿体形态异常,类囊体片层结构较少,而野生型叶绿体形态正常,类囊体片层结构排列有序。CRISPR-Cas9敲除位点鉴定结果表明,LOC_Os01g73450发生单碱基插入,导致蛋白翻译提前终止,该基因编码351个氨基酸的蛋白突变为55个氨基酸的截短蛋白。与野生型相比,LOC_Os01g73450的表达水平在突变体中显著下调。qRT-PCR结果表明YGL3在水稻根、穗、种子、叶鞘以及叶片中均有表达,且叶片中表达水平最高。YGL3编码一个质体定位的尿嘧啶核苷酸激酶。蛋白氨基酸序列比对表明YGL3蛋白在玉米、高粱、拟南芥等物种中均较为保守,与拟南芥同源蛋白氨基酸的同源性为59.4%。qRT-PCR结果表明,叶绿素合成基因（如HEMC、HEME和URO-D）在突变体ygl3中显著下调,而HEMB、HEMF和HEML等叶绿素合成基因在野生型与突变体之间无显著差异。酵母双杂交系统筛选水稻叶片酵母cDNA文库,发现YGL3与RNA编辑因子MORF8存在互作。【结论】 水稻黄绿叶突变体ygl3的表型是由LOC_Os01g73450突变导致,该基因与已报道的水稻黄绿叶基因YL2/YGL8等位。YGL3在叶片中高度表达,同时YGL3与MORF8在酵母中互作。     

谷子条纹叶突变体A36-S的细胞学特性分析及基因定位

【目的】谷子是C₄模式植物,其叶色突变体是研究C₄光合途径的良好材料。通过研究谷子条纹叶突变体A36-S的细胞学特性并对突变基因进行定位,为克隆突变基因、解析谷子叶绿体合成及发育机理、进一步理解C₄光合调控机制奠定基础。【方法】谷子条纹叶突变体A36-S是由育种创制的中间材料A36自然变异而来。对比A36-S及其正常表型等基因系A36-N的表型特征,调查二者的株高、叶宽、叶长、穗重、千粒重、结实率等农艺性状指标;测定A36-S和A36-N的叶绿素含量、净光合速率、胞间CO₂浓度、气孔导度、蒸腾速率等光合指标,分析A36-S的光合特性;观察A36-S和对照品种豫谷1号的叶片半薄横截切片和超薄切片,分析A36-S叶片解剖结构特征,分别统计叶肉细胞和维管束鞘细胞中叶绿体的数量和面积,从而分析叶绿体合成及发育情况;构建A36-S×SSR41的F₂分离群体,统计群体中正常表型单株与条纹叶单株的数量,进行遗传分析;分别构建F₂分离群体正常单株与条纹叶单株的DNA混池,采用集团分离分析法（BSA法）进行突变基因的定位;筛选、开发多个SSR标记及In-Del标记,扫描F₂群体中条纹叶单株,进行进一步基因定位。【结果】谷子条纹叶突变体A36-S在全生育期表现出叶片不规则白色条纹的表型。农艺性状分析表明,相比其近等基因系A36-N,A36-S在株高、叶宽、穗重、千粒重、结实率等表型上均显著下降。光合指标测定表明A36-S叶片中叶绿素含量明显降低,尤其是叶绿素b含量下降更为严重,同时净光合速率也明显下降。叶片解剖结构观察发现,与对照豫谷1号相比,A36-S的Kranz结构变化并不明显,但叶绿体数量和大小都显著低于对照。观察叶绿体超微结构,发现A36-S的不同细胞间叶绿体发育状况差异较大,依据叶绿体发育情况可将叶片细胞可分为3类：Ⅰ类细胞具有正常发育的叶绿体;Ⅱ类细胞叶绿体基粒及片层结构减少;Ⅲ类细胞则叶绿体结构严重异常甚至不含有叶绿体。遗传分析表明A36-S表型受隐性单基因控制,利用F₂分离群体将突变基因定位在第4染色体7.66—27.90 Mb区间内。【结论】谷子A36-S条纹叶突变体表现为农艺性状及光合能力下降,叶片细胞叶绿体的数量、大小及结构均表现出显著异常。条纹叶性状受隐性单基因控制,利用分子标记将候选基因定位于第4染色体7.66—27.90 Mb区间内。     

赤霉素GA4是水稻矮化特征的重要调节因子

【目的】 以水稻幼胚组培过程中获得的一株半矮化水稻突变体为研究对象,解析水稻半矮化突变体株高变矮及分蘖增多等表型异常的原因,为克服水稻过度矮化发育障碍因子及培育抗倒伏高产水稻品种提供科学理论依据。【方法】 首先统计分析半矮化水稻突变体与野生型的表型差异,利用体式显微镜和光学显微镜观察突变体花的结构及其细胞特征;通过转录组测序及qRT-PCR分析差异基因的表达特征,并通过外源喷施赤霉素GA3处理检测突变体对外源赤霉素的敏感性;最后利用高效液相色谱和质谱联仪检测突变体内赤霉素的含量与富集特征。【结果】 表型观测与统计结果表明,突变体水稻株高比野生型减少56.59%,有效分蘖数高出47.44%,差异均达到极显著水平。突变体的表皮毛消失且花发育迟缓,雄蕊变小。尽管突变体分蘖数较高但结实率明显降低,仅为野生型的12.62%,且种子长度和宽度均减小,差异极显著。通过显微镜观察茎的纵切切片,发现突变体细胞长度减少23%,差异极显著。外源喷施赤霉素后突变体的株高、有效分蘖、结实率、种子大小、表皮毛和茎秆细胞长度均有不同程度的恢复,说明植物体内赤霉素合成不足可能是引起水稻矮化的主要原因。转录组测序结果显示突变体中OsGA13ox 显著上调,qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。由于OsGA13ox控制GA12转化为GA53,而GA12和GA53分别转化为GA4和GA1,GA4的活性高于GA1,因此,突变体中GA4减少可能是导致半矮化的主要原因。赤霉素检测结果表明突变体中GA4含量减少94.9%,与预测结果一致。此外,D14作为SL（独脚金内酯）的特异性受体,参与调控植物SL信号转导,抑制枝条分枝或者分蘖。qRT-PCR结果显示,与野生型相比,突变体中D14 显著下调,而经过GA3处理的野生型和突变体中D14 均显著上调。D14 上调可能导致有效分蘖数减少,而其下调可能致使有效分蘖数增加。统计结果表明突变体中有效分蘖显著增多,而经过GA处理之后,野生型和突变体有效分蘖数均显著低于未经GA3处理前,表明D14 在水稻中的表达可能受到GA的调控从而影响水稻分蘖。【结论】 OsGA13ox 异常表达导致活性更高的GA4在水稻中的富集减少,形成水稻半矮化突变体;赤霉素可能通过影响D14 的表达间接调控水稻的分蘖。     

调控玉米株高和穗位高候选基因Zmdle1的定位

【目的】株高是玉米株型育种的重要目标性状之一,不仅与玉米籽粒的机械化收获及抗倒伏相关,也与玉米产量密切相关。因此,挖掘玉米株高 QTL/基因并解析其功能具有重要的理论和育种价值,定位一个新的玉米矮秆基因 ZmDLE1,阐明其生物学功能,为加速改良玉米的株型提供重要的理论依据和基因资源。【方法】利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱变甘肃省农业科学院作物研究所自育玉米骨干自交系 LY8405,M₂后代分离获得一个单基因调控隐性遗传的玉米矮秆低穗位突变体,M₃、M₄后代能稳定遗传,命名为 dwarf and low ear mutant1(Zmdle1),通过与 Mo17 杂交构建 F₂分离群体,借助极端性状混池测序分析法(BSA-seq)及目标区段重组交换鉴定的方法,基于 Mo17 参考基因组对目标区段内的基因进行挖掘和功能注释,定位候选基因。【结果】开展了 Zmdle1 表型鉴定,突变体 Zmdle1 苗期表型与对照 LY8405 无显著性差异,成熟期植株株高和穗位高较 LY8405 分别降低 87...     

超量表达CsGH3.6通过抑制生长素信号转导 增强柑橘溃疡病抗性

背景 由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起的柑橘溃疡病是柑橘生产上最具毁灭性的一种病害。植物生长素在调控柑橘溃疡病菌引起的寄主侵染部位脓疱形成中起重要作用。生长素早期响应基因GH3通过酰基化吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）调控植物激素动态平衡。前期研究发现柑橘CsGH3.6在调控生长素响应溃疡病侵染中起着重要作用。目的 通过对超量表达CsGH3.6转基因晚锦橙的抗病性、植株表型、细胞和激素变化进行分析,利用RNA-Seq解析CsGH3.6调控的信号通路,探明CsGH3.6调控激素动态平衡影响柑橘溃疡病抗性的内在机制。方法 利用针刺法对离体转基因叶片接种溃疡病菌Xcc,统计接种第10 天时病斑面积和病情指数,以野生型为对照,评价转基因植株的抗性水平;提取感病前后叶片内源激素,利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography,HPLC )检测转基因植株中激素含量变化;温室中观察转基因植株表型变化;通过测量叶片纵径、横径和厚度分析转基因植株叶型变化特征;制备叶片表皮切片,显微观察表皮细胞和气孔,并统计转基因植株表皮细胞长度和气孔密度;采用RNA-Seq测序技术研究转基因植株转录组变化情况,并利用Nr、Nt、Pfam、COG、SwissProt和gene ontology (GO)数据库注释基因功能,进一步利用KEEG数据库和MapMan软件解析超量表达CsGH3.6影响的重要基因、功能和途径,阐明CsGH3.6调控柑橘溃疡病抗性的分子机制。结果 超量表达CsGH3.6显著增强转基因植株的溃疡病抗性;转基因植株分枝增多且下垂,叶片向上卷曲,变小,颜色浅;转基因植株气孔密度增加,表皮细胞变短;激素含量分析显示,转基因植株自由生长素（IAA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量显著降低,而水杨酸（salicylic acid,SA）含量显著增加;转录组测序分析表明,超量表达CsGH3.6显著抑制生长素信号转导相关基因表达,特别是所有注释的Aux/IAA家族基因均下调表达,相反,与生物胁迫相关基因的表达为上调,其中绝大部分基因为病程相关蛋白基因。结论 超量表达CsGH3.6通过酰基化自由IAA抑制生长素信号转导,调控JA和SA的动态平衡,改变细胞和植株的形态建成,从而增强柑橘对溃疡病的抗性。研究结果暗示调控激素动态平衡在柑橘抗病育种中具有潜在价值。     

甘蓝型油菜半矮秆突变体dw-1的遗传分析与激素响应特性

【目的】株高是影响油菜抗倒性、丰产性和全程机械化进程的关键性状,油菜矮秆、半矮秆资源的发掘与研究,是实现株高遗传改良的关键。目前油菜优异矮源缺乏,通过对获得的甘蓝型自然矮化突变体进行表型鉴定、遗传分析及激素相关形态学、生理学分析,旨在综合评估其利用潜能,为其在油菜矮化育种中的应用提供理论指导并为后续基因定位、克隆奠定基础。【方法】将甘蓝型油菜品系141492自交6代后发现的半矮秆突变体经游离小孢子培养获得DH系群体,选取1个半矮DH系,暂命名dw-1,其平均株高约95 cm,变幅83—105 cm。对dw-1农艺性状、经济性状、抗病性等进行表型鉴定,并以dw-1与野生型高秆为亲本构建6世代遗传群体,应用主基因+多基因混合遗传模型对株高进行遗传分析。通过光暗处理（16 h光照/8 h黑暗、24 h黑暗）形态学观察、下胚轴与茎秆赤霉素敏感性测验,鉴定突变体突变类型。【结果】与野生型相比,dw-1千粒重无明显变化,菌核病病指、二次分枝数、单株角果数显著或极显著增加,主序有效长、一次分枝数、株高、分枝部位高度、重心高度、主序角果数、每角粒数、单株产量显著或极显著降低,全生育期极显著缩短。遗传分析表明,dw-1株高的遗传受1对加性-显性主基因+加性-显性-上位性多基因控制（D-0模型）,主基因加性效应-47.5,显性度0.2;B₁、B₂、F₂主基因遗传率分别为76.0%、84.0%、85.0%,多基因遗传率分别为4.1%、5.6%、6.7%。光照与黑暗条件下,dw-1形态建成正常且下胚轴长度均极显著低于野生型。外施低浓度赤霉素对下胚轴与茎秆伸长作用不明显,高浓度处理有显著促进作用,但均不能恢复至野生型表型。【结论】dw-1田间综合性状优良,矮生性状以1对加性-显性主基因遗传为主,主基因又以加性效应为主,常规杂交育种早代选择有效。dw-1矮化机制与油菜素内酯途径无关,为赤霉素敏感性减弱应答类型。