拟南芥RING E3连接酶AtASSR1在盐胁迫响应中的功能初探

【目的】构建拟南芥AtASSR1转基因株系,研究并初步揭示RING E3连接酶AtASSR1在盐胁迫应答中的作用。【方法】利用农杆菌介导的花序浸染法,成功获得AtASSR1基因插入的纯合转基因株系,并通过检测盐胁迫处理前后,转基因株系及野生型、atassr1突变体植株中生理生化指标来初步揭示AtASSR1的功能。【结果】通过检测盐胁迫处理前后,不同基因型株系的H_2O_2、过氧化氢酶活性、丙二醛的含量,发现转基因株系中的过氧化氢酶活性最低,而积累的H_2O_2与丙二醛含量最多;分析脯氨酸含量发现,盐胁迫处理后突变体株系的脯氨酸含量积累最多。【结论】E3连接酶AtASSR1可能在介导植物响应盐胁迫等非生物胁迫的应答中发挥重要生理功能。     

硒盐胁迫对拟南芥耐硒突变体和野生型抗氧化酶类活性的影响

研究了硒盐胁迫对拟南芥耐硒突变体和野生型抗氧化酶类活性的影响,发现在高浓度硒胁迫下,植物体内的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性均升高,而且拟南芥耐硒突变体58(5)中这几种酶的活性均明显高于野生型拟南芥WT中的。说明突变体58(5)具有较强的耐硒特性。     

硒盐胁迫对拟南芥耐硒突变体和野生型抗氧化酶类活性的影响

研究了硒盐胁迫对拟南芥耐硒突变体和野生型抗氧化酶类活性的影响,发现在高浓度硒胁迫下,植物体内的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性均升高,而且拟南芥耐硒突变体58(5)中这几种酶的活性均明显高于野生型拟南芥WT中的。说明突变体58(5)具有较强的耐硒特性。     

水稻突变体对土壤汞胁迫耐性机理的初步研究

    研究水稻中花11及其汞耐性突变体对土壤汞的耐性差异和引起差异的主要原因.采用盆栽土培试验,研究不同浓度Hg2+处理对野生型和突变体生长发育、产量、叶绿素含量、净光合速率、丙二醛(MDA)含量、水稻各器官Hg2+浓度和主要抗氧化酶活性的影响.结果表明:野生型和突变体经Hg2+胁迫后表型上有显著差异,突变体对Hg2+的耐性大于野生型.Hg2+对野生型生长发育和产量的抑制作用明显大于突变体;随着Hg2+浓度的增加,野生型叶绿素、净光合速率下降速度更快;突变体叶片中超氧阴离子(O2˙)产生速率和过氧化氢(H2O2)积累量低于野生型,野生型叶片膜脂过氧化程度更高;野生型和突变体的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性及野生型的愈创木酚过氧化物酶(G-POD)活性、突变体的抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均呈现先上升后下降的趋势;而突变体的G-POD活性和野生型的APX活性呈现上升趋势.与突变体相比,野生型叶片中抗氧化酶活性受到更显著抑制;突变体较强的抗氧化胁迫能力与其对Hg2+的耐性密切相关.     

过量表达OsAPX1基因增强水稻的抗热和抗氧化能力

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是植物体内活性氧清除的关键酶,在植物逆境应答中发挥着重要作用。通过构建水稻OsAPX1基因的过表达植物载体,利用根癌农杆菌介导法导入水稻品种日本晴获得转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中OsAPX1表达水平明显提高。田间T0代过表达转基因植株在高温条件下的秕谷率显著低于野生型。热激胁迫实验显示,转基因株系比野生型具有更强的耐热性。在过氧化氢胁迫下,转基因植株也表现出更强的抗氧化能力。该结果表明水稻OsAPX1基因在活性氧清除中发挥功能,过量表达OsAPX1能够增强水稻的高温抗性。     

棉花E3泛素连接酶基因GhRING1-like的克隆及功能分析

[目的]RING(really interesting new gene) finger E3泛素连接酶在植物生长发育和抵御环境胁迫中具有重要作用。克隆棉花RING finger E3泛素连接酶基因GhRING1-like并分析其表达特征和功能,为该基因分子作用机制研究和育种应用奠定基础。[方法]根据棉花表达谱分析,选取并克隆干旱胁迫处理上调表达基因GhRING1-like,qRT-PCR分析GhRING1-like的组织表达特性及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式;采用瞬时表达对GhRING1-like-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析;通过获得病毒介导的基因沉默(VIGS)棉花和过表达拟南芥植株,分析沉默或过表达GhRING1-like对植株生长发育及其抗旱性的影响。[结果]GhRING1-like基因序列全长996 bp,编码332个氨基酸,其C端含有RING-H_2(C3H_2C3)结构域。GhRING1-like定位于内质网上。GhRING1-like在叶片中优势表达; 200 g·L~(-1)PEG6000诱导处理1 h后瞬时显著上调表达12倍; GhRING1-like对Na Cl、ABA和SA的响应时间都在处理后3 h,上调表达均在5倍左右。干旱胁迫处理后,VIGS沉默GhRING1-like棉花叶片相对含水量和叶绿素荧光参数Fv/Fm分别较未沉默对照降低17.1%和30.6%,而电解质渗透率和丙二醛含量分别较对照提高70.8%和100%。过表达GhRING1-like显著提高了拟南芥种子萌发和幼苗期对于甘露醇引起的渗透胁迫的耐受性;可使营养生长中后期阶段的拟南芥在水分亏缺处理下的存活率提高2.4倍;转基因拟南芥叶片气孔开度降低51.2%,失水率明显降低。干旱胁迫下,过表达GhRING1-like使依赖于ABA诱导表达的At AREB1、At ERD15、AtRD29A上调表达,而对不依赖ABA的干旱胁迫诱导基因At DREB和脯氨酸合成基因At PLD没有影响。[结论]棉花GhRING1-like参与了植物非生物胁迫抗性的调控,主要通过依赖于ABA通路正向调控植物的抗旱反应。     

大豆GmGolS2-1基因高温胁迫诱导表达及转基因烟草鉴定

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉籽糖系列寡糖(RFO)生物合成途径中的关键酶,在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用.实时荧光定量RT-PCR结果显示,高温胁迫可以诱导GmGolS2-1在大豆幼苗中的表达.将GmGolS2-1基因构建到植物表达载体pRI101上并通过叶盘法转化烟草,经卡那霉素抗性筛选,PCR及qRT-PCR检测共获得6株阳性转基因烟草植株(OE1～OE6).对野生型烟草植株和GmGolS2-1转基因烟草植株进行高温胁迫处理,结果显示野生型烟草的电解质渗透率和丙二醛含量均高于转基因烟草.由此推测GmGolS2-1可以提高转基因烟草的耐热性.     

铅污染对不同生境芦苇体内抗氧化酶系统的影响

为评估不同生境芦苇对铅污染的耐受或抵抗能力,采用盆栽试验模拟淹水和干旱生境,探究铅污染对不同生境芦苇体内蛋白质、丙二醛含量以及抗氧化酶活性的影响。结果表明,随着铅处理浓度增加和胁迫时间增加,芦苇体内丙二醛含量显著增加,但过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性也均显著增强。相同浓度铅处理的干旱生境芦苇体内超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性均小于淹水生境芦苇。胁迫60 d,铅处理的两种生境芦苇体内过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性均显著增强;胁迫90 d,铅处理的两种生境芦苇体内的超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性均显著大于对照。说明水生芦苇具有较强的抗氧化能力,超氧化物歧化酶和过氧化物酶在抵抗铅诱导的氧化胁迫中发挥重要作用。     

非生物胁迫下植物体内丙酮醛代谢的研究进展

由于植物固着生长,其无法通过移动来逃避逆境,故非生物胁迫（如极端温度、盐胁迫、干旱或光胁迫等）会伴随着植物的整个生长发育过程,严重胁迫植物的分布、生长、品质和产量,甚至生存。植物只能通过改变自身形态结构以及生理生化反应来适应环境,或者通过释放化学物质来影响周边其他植物的生长发育,以改变微环境,使环境向着更适合自己生长的方向发展。丙酮醛（methylglyoxal,MG）又称之为甲基乙二醛,作为植物体内正常的生理代谢产物可由多条途径产生,其最主要的来源是糖酵解途径,如糖酵解中间体二羟丙酮磷酸和甘油醛3-磷酸去除磷酸基。而植物体内MG的分解主要靠乙二醛酶系统,包括乙二醛酶I、乙二醛酶II以及还原型谷胱甘肽,MG经乙二醛酶降解后形成D-乳酸。在正常生长条件下,植物体内的MG含量维持在较低水平,而当植物遭受非生物胁迫时,其含量会迅速升高;植物体内的MG含量过高会破坏植物细胞的增殖和生存,控制细胞的氧化还原状态以及其他许多方面的新陈代谢过程,最终导致生物大分子蛋白质、DNA、RNA、脂质和生物膜的破坏。因此,MG现在被认为是植物非生物胁迫耐受性的潜在生化标志物,并受到科学界的广泛关注。该文结合最新的研究进展,对非生物胁迫下植物体内丙酮醛合成及降解机制予以综述。     

一个水稻早衰突变体基因的精细定位

【目的】对水稻叶片早衰突变体W330进行遗传分析及精细定位,获得控制突变表型的基因。【方法】用60Co-γ辐射诱变籼型水稻恢复系中恢8015,从突变体库获得一份叶片早衰突变体W330。对该突变体进行表型观察和主要农艺性状调查。利用多代自交稳定的突变体W330与粳稻品种02428杂交,观察F1和 F2的表型,并统计F2群体中早衰突变表型与正常野生型的分离情况,分析该突变表型的遗传行为。利用构建的F2群体进行精细定位和候选基因分析,然后对候选基因进行DNA测序、酶切分析、表达分析、酶活测定及进化分析。【结果】突变体W330从三叶期开始出现叶片衰老,直至抽穗期及黄熟期。与野生型相比,突变体W330株高变矮、分蘖减少、叶片变窄、抽穗期不变、每株有效穗数、每穗着粒数和结实率亦显著降低。W330与02418杂交的F1表现正常,F2群体中正常植株与早衰突变植株的分离比符合3﹕1,表明突变体W330的突变性状受1对隐性核基因控制。利用F2定位群体及SSR、Indel标记,最终将目标基因定位在第3染色体短臂上2个分子标记CD-5与CD-7之间,物理距离约为21.5 kb。基因预测表明该区域共有4个完整的ORFs。其中,LOC_Os03g0131200编码一个过氧化氢酶OsCATC,基因组序列分析表明,W330突变体中的该基因从ATG开始第109位,在第一个内含子的末位发生了一个C到G的颠换,造成第一个内含子没有剪切,最终导致翻译提前终止,酶切试验验证了这一突变位点。与野生型亲本中恢8015相比,W330突变体在三叶期叶片中的过氧化氢酶的活力下降了47.8%,而过氧化氢含量上升了2.7倍。由此,推定W330与OsCATC等位。系统进化分析发现,OsCATC与水稻中同源的过氧化氢酶不在同一进化分支上。实时荧光定量PCR发现,与其野生型相比,突变体W330叶片中的OsCATA和OsCATB的表达量显著上升,而OsCATC的表达量没有明显的变化。推测,这3个高度同源的基因在水稻体内可能存在互补机制。【结论】W330突变体基因是已报道的过氧化氢酶基因OsCATC的等位基因。W330突变体在第一个内含子上发生的一个点突变造成可变剪切的发生,使得水稻一个过氧化氢酶失活,导致突变体W330突变表型的出现。     

中华水韭耐重金属胁迫基因的分离

以中华水韭为试验材料,用200μmol·L-1的氯化镉溶液和2g·L-1的硝酸铅分别对其进行胁迫处理,采用cDNA-AFLP技术分离差异表达基因,通过Blast（The Basic Local Alignment Search Tool）同源性比对分析基因功能,为寻找耐重金属胁迫相关基因和揭示水韭对环境变化响应的分子机理奠定基础。试验结果如下：共有15条差异条带被成功克隆和测序,其中13条差异片段可以在数据库找到与之同源的序列。镉胁迫差异表达TDF9与ABC型（ATP-binding cassette）转运蛋白C亚族基因有84%同源性。铅胁迫差异表达TDF4和TDF7与环形锌指蛋白（RING Zinc Finger Protein）有75%同源性。这些基因的发现为揭示水韭对环境变化敏感的分子机理奠定基础。     

玉米CCCH基因家族鉴定及分析

CCCH锌指蛋白与植物生物和非生物胁迫、生长发育及抗病性密切相关。以玉米为材料,应用在线工具与公共数据库,共鉴定出63个CCCH基因,命名为Zm CCCHs,进一步对玉米与水稻、拟南芥、小立碗藓的CCCH基因进行生物信息学分析。结果表明:玉米的CCCH家族基因在染色体上呈不均匀分布,蛋白质氨基酸序列长度在110～962 aa之间。Zm CCCHs基因具有相对保守的结构,即包含CCCH结构域、WD40结构域、C2H2结构域、C3HC4结构域,CCCH蛋白结构中含有2个α螺旋和4个β折叠结构域。进化树分析表明玉米CCCH蛋白与水稻CCCH蛋白序列具有较高的同源性。上述结果为深入研究该基因家族的功能与表达调控提供了参考信息。     

基于转录组的油茶DHHC型锌指蛋白基因家族的鉴定及分析

DHHC型锌指蛋白参与细胞内蛋白质的棕榈酰化修饰,对植物的生长发育、器官形成、生殖发育及胁迫响应等生命活动具有重要的调控作用。基于油茶叶片转录组数据,筛选出23个DHHC型锌指蛋白基因,应用生物信息学方法对其蛋白理化性质、结构域、系统进化等进行了分析。结果表明,23个DHHC型锌指蛋白的序列大小为195~725 aa,均包含一个保守的DHHC-CRD结构域,大部分DHHC型锌指蛋白具有4个跨膜区,主要定位于细胞核和细胞膜中。系统进化分析将其分为4类,与拟南芥和水稻均有不同程度的同源关系,DHHC型锌指蛋白在不同物种间具有遗传保守性。23个DHHC型锌指蛋白基因在结实量大和结实量小的单株的不同发育时期叶片中均有不同程度的表达。CoDHHC9、CoDHHC13、CoDHHC22在油茶抽梢生长期的叶片中表达上调;CoDHHC6、CoDHHC12、CoDHHC18、CoDHHC23在花芽分化时期和果实成熟时期的叶片中表达量较高,且在结实量较小而开花较多的单株中表达上调更为明显,这些基因可能参与油茶花芽分化及花朵发育过程;CoDHHC5、CoDHHC11、CoDHHC15在不同时期的叶片中表达量均较低。研究结果为进一步对油茶DHHC型锌指蛋白家族基因的克隆和功能分析提供依据,有助于进一步研究该基因家族在油茶生殖发育中的调控功能。     

苋色藜NDR1基因抗病毒特性初步研究

以抗病毒植物苋色藜为材料,克隆拟南芥NDR1的同源基因,确定其亚细胞定位及该基因表达和抗病毒特性分析,为转基因抗病育种奠定技术基础。根据苋色藜转录组测序分析结果,采用RT\|PCR克隆获得两个与拟南芥同源的NDR1基因,分别命名为CaNDR1a和CaNDR1b,并通过实时定量PCR分析病毒侵染后基因的表达情况;构建植物瞬时表达载体,发现CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜;构建CaNDR1a和CaNDR1b植物表达载体,遗传转化获得转基因烟草,经酶联免疫吸附测定（ELISA）分析T1代植株对烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性。生物信息学分析揭示CaNDR1a和CaNDR1b是NDR1的同源基因。CaNDR1a和CaNDR1b在苋色藜接种TMV和CMV后显著上调表达。CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜上,并且病毒对CaNDR1a和CaNDR1b的胞内定位没有影响。ELISA结果显示部分转基因株系对TMV和CMV的抗性增加。初步表明CaNDR1a和CaNDR1b是拟南芥NDR1的功能性同源基因,参与植物对病毒的内源免疫反应。     

木薯环指蛋白基因MeRFP8克隆及表达

采用RT-PCR方法,首次从木薯华南8号(SC8)克隆一个环指蛋白RFP基因家族成员MeRFP8.该基因c DNA包含1059 bp的开放阅读框,编码一个由352个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质分子质量为39.23 ku,理论等电点为4.84,C末端含有保守的结构域RING finger domain(Ring-H2 zinc finger),属于C3H2C3型环指蛋白.利用实时荧光定量PCR分析MeRFP8基因在木薯SC8及其同源四倍体叶片的表达水平,结果显示:5℃低温胁迫24 h内,SC8和其四倍体MeRFP8基因先下调表达,后上调表达,呈"V"字型.而且MeRFP8基因在SC8的表达变化水平比其同源四倍体大.推测MeRFP8基因可能参与木薯的低温响应.     

陆地棉GhbHLH4基因的克隆与功能分析

bHLH是一类存在于真核生物中的转录因子家族,其成员广泛参与到植物生长发育及抗逆过程之中。但是,在棉花中有关bHLH基因功能的研究报道不多。以陆地棉为材料分离克隆了GhbHLH4基因并对其功能进行了初步分析。结果表明：GhbHLH4基因启动子中含有大量与抗逆相关的顺式作用元件;转GhbHLH4基因的拟南芥植株与野生型相比叶片宽大、根系发达,转GhbHLH4基因植株能够耐受150 mmol/L NaCl并完成整个生长过程。研究结果为深入了解GhbHLH4基因耐盐的分子机理奠定了基础。     

条锈菌诱导的小麦C3HC4型锌指蛋白基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中首次分离出1个条锈菌诱导的编码C3HC4型锌指蛋白基因的cDNA序列,暂被命名为TaZFP1。TaZFP1包含一个完整的849 bp的开放阅读框,编码282个氨基酸,具有C3HC4保守结构域;小麦TaZFP1氨基酸序列与水稻OsZFP1相似性达89%,与玉米ZmZFP1相似性达81%。TaZFP1在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaZFP1基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合,表明TaZFP1可能参与小麦对条锈菌的防御反应。     

两个高度同源的RING结构域蛋白功能初步研究

泛素化途径在植物应答生物和非生物胁迫中起着重要作用,其中E3连接酶在泛素化途径中起着决定性作用。室通过在线基因芯片预测发现2个与非生物胁迫相关的拟南芥RING结构域蛋白基因At2g24480（HHR1）、At5g43200(HHR2)通过体外泛素化实验证明了二者具有E3连接酶活性。对这两个E3连接酶进行了亚细胞定位,表达谱和组织特异性分析,发现二者受诱导后的表达情况、组织特异性、亚细胞定位均不同。HHR1定位于细胞膜上,HHR2定位于细胞核;表达谱分析表明HHR1响应热和H2O2胁迫,而HHR2响应盐和H2O2胁迫;HHR1在根和花中的表达量较高,在茎和叶中的表达量较低,而HHR2在根、茎、叶中的表达量都较高,在花中表达量较低。该研究结果证实了HHR1和HHR2的一些性质和亚细胞定位,为深入研究其功能奠定了基础。     

UHRF1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells

Epigenetic inheritance in mammals relies in part on robust propagation of DNA methylation patterns throughout development. We show that the protein UHRF1 (ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains 1), also known as NP95 in mouse and ICBP90 in human, is required for maintaining DNA methylation. UHRF1 colocalizes with the maintenance DNA methyltransferase protein DNMT1 throughout S phase. UHRF1 appears to tether DNMT1 to chromatin through its direct interaction with DNMT1. Furthermore UHRF1 contains a methyl DNA binding domain, the SRA (SET and RING associated) domain, that shows strong preferential binding to hemimethylated CG sites, the physiological substrate for DNMT1. These data suggest that UHRF1 may help recruit DNMT1 to hemimethylated DNA to facilitate faithful maintenance of DNA methylation.     

番茄YABBY基因家族的生物信息学分析

YABBY基因家族是植物特有转录因子,与植物形态有关,在植物叶和花器官发育过程中起重要调控作用。试验在番茄基因组范围内鉴定出9个YABBY基因家族成员,分别位于第1、5、6、7、8、11和12号染色体。利用MEGA程序对番茄、拟南芥、大白菜和玉米YABBY基因家族作进化分析,进化树可分为四个亚组;利用GSDS程序分析基因结构保守性,显示Sl YABBY基因内含子保守5~6个;MEME程序作基序分析,显示Sl YABBY基序保守,经鉴定所有Sl YABBYs均具有C2C2锌指结构域及YABBY结构域。运用plant CARE软件分析顺势作用元件发现,在番茄YABBY基因上游1 000 bp序列中存在多个应答不同生物和非生物胁迫的顺式作用元件,且种类和数目不同,表明其作用于番茄生长发育和逆境胁迫过程。基因功能预测和蛋白-蛋白网络分析表明,番茄YABBY家族对根、茎、叶、花、蜜腺、心皮、胚珠等部位发育具有重要调控作用。番茄YABBY基因家族表达分析发现Sl YABBY1、Sl YABBY3和Sl YABBY4在根、茎、花、叶及果实中均无表达,Sl YABBY2和Sl YABBY9表达具有较强组织特异性,为番茄YABBY基因功能研究提供参考。