饲料用米曲霉酸性蛋白酶研究

[目的]研究米曲霉酸性蛋白酶的纯化技术以及催化特性,为米曲霉酸性蛋白酶的开发和利用提供理论依据。[方法]采用丙酮沉淀,DEAE—Sephadex A-50柱层析方法分离纯化了米曲霉酸性蛋白酶,以酪蛋白为底物对其酶学性质进行了研究：[结果]结果表明：纯化倍数达到20．77;该酶最适pH值为6．0,最适温度为45℃;Fe^2＋、Mg^2＋对该蛋白酶的活性有明显的抑制作用,而Mn^2＋、Cu^2＋对该蛋白酶的活性有明显的激活作用。该蛋白酶Km=4．704mg/ml,Vmax=22．27μg／min。[结论]米曲霉蛋白酶具有很好的应用前景。     

蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE—Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu^2＋、Mg^2＋、Fe^2＋对该酶有抑制作用,而Ca^2＋对其则有一定程度的激活作用;该酶在50—60℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟（PMSF）可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

不同温度、pH和无机离子对黑曲霉A66菌株产柚苷酶活力影响的初步研究

对黑曲霉产柚苷酶的最适温度和pH进行了研究，发现最适反应温度在60℃，最适反应pH在5．0左右。同时研究了不同的无机离子在不同浓度下对柚苷酶活性稳定性的影响，发现I^-，Zn^2＋能促进柚苷酶活性的提高，Cu^2＋在（0—0．004）mg／mL的范围内也能激活柚苷酶的活性。     

黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

[目的]分离能水解獐牙菜苦苷的胞外β-葡萄糖苷酶,并研究其分子量、最适催化温度、最适pH、稳定性及催化特征。[方法]黑曲霉液体发酵3d,收集培养液,培养液经盐析、柱分离得到1个β-葡萄糖苷酶。[结果]该β-葡萄糖苷酶的分子量为86kD,最适pH为5.0～6.0,最适反应温度为50～60℃,在60℃以下时酶稳定;Ca2＋、Zn2＋、Fe3＋和Cu2＋能抑制β-葡萄糖苷酶的活性,而Mg2＋和Mn2＋能够激活β-葡萄糖苷酶的活性;纤维二糖是该β-葡萄糖苷酶的最适催化底物。[结论]该酶和大多数真菌来源黑曲霉相似,对獐牙菜苦苷的亲和性弱,对ρ-NPG的亲和力强。     

菠萝蛋白酶部分酶学性质的研究

通过菠萝蛋白酶的最佳吸收峰、酶的浓度及大小,红外光谱分析和酶活性的测定,研究菠萝蛋白酶的部分性质。结果表明,菠萝蛋白酶具有热稳定性,其大小约为28.8 kD ,且最适温度为60℃,最适p H为7.5。Fe^2＋对菠萝蛋白酶有激活作用,Z n^2＋、C u^2＋低浓度有促进作用,高浓度有抑制作用,NaCl对菠萝蛋白酶能起到一定的保护作用、KCl对酶反应影响不大,MgSO4·7H2O和无水CaCl2对菠萝蛋白酶活性均有一定程度的抑制作用。菠萝蛋白酶经pH2.5胃蛋白酶和 pH3.2胃蛋白酶作用后,随处理时间的延长,其酶活力都呈下降的趋势。其中,pH2.5条件下的胃蛋白酶对菠萝蛋白酶活力的影响较大。表明在模拟猪胃条件下pH2.5胃蛋白酶对菠萝蛋白酶影响较大。     

普鲁兰短梗霉N2-3菌株碱性蛋白酶的纯化及性质研究

[目的]对普鲁兰短梗霉N2-3菌株的碱性蛋白酶进行纯化,并对其性质进行研究。[方法]利用层析柱Sephadex G-75与阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化菌株N2-3的胞外碱性蛋白酶,并对纯化的酶进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,同时对纯化蛋白酶的最适反应温度、温度稳定性、最适反应pH、pH稳定性进行测定,研究金属离子及各种化合物对蛋白酶活性的影响。[结果]试验中N2-3菌株的碱性蛋白酶纯化倍数和回收率分别为2.34和25.9%;SDS-PAGE凝胶电泳显示该酶的分子量约为33 kDa;该酶的最适反应温度和pH分别为52℃和9.0;Mn2+、Mg2+、Na+离子浓度在5 mmol/L时对纯化蛋白酶的酶活有激活作用,Zn2+、Ca2+、K+、Li+对酶活的影响不大,而当存在Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ag+、Hg2+离子时,蛋白酶活明显降低;苯甲基硫酰氟(PMSF)强烈抑制了该蛋白酶的活性,而乙二胺四乙酸(EDTA)与碘乙酸微弱抑制了该蛋白酶的活性。[结论]为普鲁兰短梗霉N2-3菌株碱性蛋白酶的工业化生产提供了一定的理论基础。     

豇豆CAT活性的研究

[目的]对豇豆过氧化氢酶（CAT）的活性进行研究。[方法]以豇豆中的过氧化氢酶为材料,测定其活力、最适温度与pH值,及各因素对活力的影响。[结果]豇豆中过氧化氢酶的最适pH值为8.0,最适温度为25℃。甲醇和乙醇对豇豆中过氧化氢酶活性的影响均表现为低浓度具有激活作用,高浓度转为抑制作用。金属离子Cu2＋对该酶有不用程度的激活作用,而Mg2＋和Na＋则对该酶有一定程度的抑制作用。[结论]该研究为豇豆过氧化氢酶的进一步研究提供了理论依据。     

海洋氧化短杆菌15E碱性蛋白酶的酶学性质

对氧化短杆菌15E菌株(Brevibacterium oxydans)所产的碱性蛋白酶酶学性质研究表明,15E菌株所分泌的碱性蛋白酶分子质量为49.0 ku、等电点为9.3.该酶的最适作用温度为60℃,最适pH值为7.0-9.0;Ca2+、Mg2+、K+对酶有激活作用.酶对一些变性剂如SDS、尿素、盐酸胍具有一定的耐受性;PMSF和AEBSF能抑制该蛋白酶,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶;EDTA对该蛋白酶有抑制作用,说明该蛋白可能含有金属离子.     

鲢鱼(Hypophthal michthys molitrix)背肌中组织蛋白酶B2的纯化与酶学性质鉴定

对鲢鱼背部白肌中的组织蛋白酶B2,进行了分离纯化及酶学性质的鉴定。目的酶经粗提后,再通过酸处理、硫酸铵分级沉淀、超滤、DEAE-Sephacel、Sephacryl S-100、SP-Sepharose F.F.、Blue-sepharose 6 F.F.、Con A-Sepha-rose等步骤纯化,纯化倍数达到396.5倍。经SDS-PAGE分析,该酶呈现了分子量约为25和20KDa的2条带。组织蛋白酶B2的最适反应温度和pH分别为30~35℃和pH5.5。巯基还原剂DTT、L-Cys、β-Me均显著地激活了该酶的活性。50μmol/L的E-64能够完全抑制其活性。Cl-浓度为100μmol/L以内时,对组织蛋白酶B2起到激活作用,200μmol/L时则表现为抑制作用。25 mmol/L的P2O74-,即可有效抑制该酶的活性。该纯化酶能够水解Z-Arg-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA,但是不能够水解L-Arg-MCA。组织蛋白酶B2水解Z-Arg-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA的Km值分别为7.15及226μmol/L,表明Z-Arg-Arg-MCA是该酶的最适底物。     

降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1角蛋白酶纯化及酶学性质研究

利用硫酸铵分级沉淀和交联葡聚糖G-100凝胶柱纯化了高效降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1所产角蛋白酶,纯化的角蛋白酶,经SDS-PAGE蛋白电泳分析,分子量为48.3 kda.结果表明,该酶最适反应温度和最适pH值分别为50℃和9.0,30～40℃具有较好的温度稳定性,60℃酶活下降很快;在pH7.0 ～9.5的范围内具有较好的稳定性.金属离子Ni2+、Zn2+对角蛋白酶具有明显抑制作用,Cu2+、Fe2、Fe3+能完全抑制酶活;1％巯基乙醇对酶具有明显激活作用.EDTA和PMSF对该角蛋白酶几乎完全抑制,可判定该酶是丝氨酸金属蛋白酶,是一种新的蛋白酶.     

南极磷虾体内胰蛋白酶的纯化及性质研究

以南极磷虾(Euphausia superb)为研究对象,通过硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析等方法,从南极磷虾体内分离纯化出胰蛋白酶。其纯化倍数为5.44倍,比活力为38.3 U/mg,得率为26%。SDS-PAGE电泳结果显示,该酶的分子质量为28 ku。蛋白酶最适温度为37℃、最适pH为7.5,Mg2+、Ca2+、Mn2+对南极磷虾蛋白酶具有激活性,Zn2+、Cu2+、Fe3+具有酶活抑制性,其中Cu2+的抑制性最强。酶的动力学实验结果表明,以BApNA为底物测得Km为0.073 mmol/L,Vmax为1.44×10-2mmol/L·s,kcat为0.6S-1,kcat/Km为8.22×103,PMSF作为蛋白酶抑制剂,对南极磷虾蛋白酶作用机制为不可逆抑制。     

啤酒废酵母自溶过程强化研究

[目的]研究啤酒废酵母强化自溶过程,优化强化作用因素。[方法]对影响啤酒废酵母自溶后释放的超氧化物歧化酶(SOD)、氨基酸、葡萄糖内容物含量及SOD的活性提取的各因素进行单因素试验,并设计物理因素正交试验进行各因素参数优化;同时对啤酒酵母自溶后释放的上述活性物质进行添加葡聚糖酶、木瓜蛋白酶促进自溶过程的单因素影响研究,并设计化学因素正交试验进行各因素参数优化。[结果]物化因素影响的正交试验表明,啤酒废酵母自溶过程氨基酸含量提取的最优组合为pH 5.0、加水量300%、加盐量3%,葡萄糖含量提取的最优组合为pH 5.0、加水量250%、加盐量1%,SOD含量提取的最优组合为pH 5.5、加水量300%、加盐量2%,SOD活性提取的最优组合为pH 5.5、加水量250%,加盐量1%。生化因素影响的正交试验表明,氨基酸含量提取的最优组合为pH 6.0、温度60℃、酶用量6 g/kg葡聚糖酶+4 g/kg木瓜蛋白酶,葡萄糖含量提取的最优组合为pH 6.0、温度55℃、酶用量6 g/kg葡聚糖酶+4g/kg木瓜蛋白酶,SOD含量提取的最优组合为pH 6.0、温度55℃、酶用量6 g/kg葡聚糖酶+2 g/kg木瓜蛋白酶,SOD活性提取的最优组合为pH 6.5、温度60℃、酶用量6 g/kg葡聚糖酶+4 g/kg木瓜蛋白酶。[结论]在优化的啤酒废酵母自溶过程强化作用各提取物的最优组合条件下,可简化操作过程、降低操作难度,提高酵母菌成分的利用率及其得率。     

肠膜明串珠菌素ZLG85抗菌谱及稳定性的研究

从发酵酸黄瓜中筛选到一株肠膜明串珠菌ZLG85,对其产生的肠膜明串珠菌素的抗菌谱及生物稳定性进行了研究。肠膜明串珠菌素ZLG85除了对单核增生李斯特菌具有较好的抑制效果之外,还能抑制其他食品中常见的致病菌的生长,抑菌普较广。肠膜明串珠菌素在低温,低pH值条件下也能抑制单增李斯特菌的生长;对人体常见的蛋白酶具有很强的敏感性;抑菌活性随着无机盐NaCl、KCl、CaCl2、ZnSO4、MgSO4浓度的升高而降低,一价盐离子Na+、Ka+对其活性的影响小于二价盐离子Ca2+、Zn2+、Mg2+;有机溶剂对其抑菌活性影响不显著。     

鱿鱼肝脏活性肽的制备及生物活性研究

[目的]为鱿鱼肝脏的高值化利用提供基础研究数据。[方法]以鱿鱼肝脏蛋白为原料,通过蛋白酶水解来制备生物活性肽,研究了多种蛋白酶水解鱿鱼肝脏制得水解液的抗凝血活性、抑制血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE）活性及抗氧化活性。[结果]当鱿鱼肝脏水解液浓度为5 mg/ml时,中性蛋白酶的水解液对ACE抑制率为68.0%;APTT值为59.8 s,TT值为34.2 s,比空白对照组分别延长26.7和20.6 s,表明鱿鱼肝脏的中性蛋白酶水解液具有抗凝血活性。中性蛋白酶解液对Fe3＋的还原力为0.588,羟自由基清除能力为64.5%,说明鱿鱼肝脏中性蛋白酶水解液具有较好的抗氧化活性;而其余的木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶的鱿鱼肝脏水解液的抗凝血活性和ACE抑制活性均低于中性蛋白酶水解液的酶解液活性。[结论]鱿鱼肝脏蛋白质具有较好的综合利用价值。     

碱性蛋白酶水解大豆多肽及抑制ACE效果的研究

[目的]为了进行碱性蛋白酶水解大豆多肽及抑制ACE效果的研究。[方法]利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶分别水解大豆蛋白,制备具有ACE抑制活性的大豆多肽,通过正交优化试验确定碱性蛋白酶的最佳水解条件,考察底物浓度、反应时间、反应温度与大豆蛋白酶解多肽对ACE抑制活性的影响,并将超滤法和聚丙烯酰胺凝胺电泳技术相结合,考察大豆蛋白酶水解物的分子量分布。[结果]结果表明,碱性蛋白酶的最佳水解条件为底物浓度5%,加酶量4%,水解时间2h。[结论]该研究为更好地利用大豆蛋白展示了良好的应用前景。     

金属离子对红白锦鲤肠及肝胰脏蛋白酶活性的影响（摘要）（英文）

[目的]研究金属离子对红白锦鲤消化组织蛋白酶活性的影响。[方法]以酶学分析方法研究4种金属离子（Na＋、K＋、Ca2 ＋、Mg2 ＋分别来源于NaCl、KCl、CaCl2.2H2O、MgCl2.6H2O,浓度梯度均设置为25、50、75、100、125、150 mmol/L）对红白锦鲤肝胰脏、前肠、中肠、后肠蛋白酶活性的影响。蛋白酶活性的测定采用福林-酚显色法,用Thermo紫外分光光度计,根据OD680计算蛋白酶活性,以1 min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,记为μg/（min.g）。[结果]在设定的浓度范围内（25 ～150 mmol/L）,4种金属离子对蛋白酶活性影响不同。K＋对肝胰脏和后肠的蛋白酶活性有不同程度的促进作用,其中K＋对中肠表现为低浓度促进,高浓度抑制的作用,对前肠蛋白酶表现为抑制作用;Na＋对肝胰脏、前肠和后肠的蛋白酶表现为不同程度促进作用,对中肠表现为抑制作用。Mg2 ＋、Ca2 ＋对肠及肝胰脏的蛋白酶均表现为不同程度的抑制作用。试验所选用的K＋、Na＋、Mg2 ＋、Ca2 ＋均属矿物元素,其中添加浓度25 mmol/LK＋对锦鲤肠蛋白酶活性促进作用最大;浓度150 mmol/L Na＋显著提高后肠和肝胰脏蛋白酶活性。这些浓度可作为饲料添加剂中的参考用量。Mg2 ＋、Ca2 ＋对锦鲤各消化器官（中肠除外）的抑制作用随浓度的增加蛋白酶活性降低,但考虑该元素系水产动物生长发育所必需,因此可选用低浓度或螯合物进行添加,以提高酶的生物学效价,提高饲料中蛋白的利用率,降低饵料系数,节约蛋白。[结论]该研究可为红白锦鲤消化生理的研究以及配合饲料的开发、优化提供基础数据和理论依据。     

乳酸片球菌产谷氨酸脱羧酶的相关酶学性质研究

为研究乳酸片球菌谷氨酸脱羧酶（GAD）的性质,采用比色法测其酶活。结果表明：当底物L-MSG的浓度为100 mmol.L-1时,GAD的活力达到最大。GAD的浓度为3.16%,最适温度为37℃,最适pH为5.0,PLP浓度为0.1 mo.lL-1时,GAD酶活力最大。Mg2＋和Mn2＋使GAD活力提高10%左右,KCl...     

枇杷果肉漆酶酶学特性研究

研究枇杷果肉漆酶（EC 1.10.3.2）的提取及其理化性质,为探讨漆酶在冷藏枇杷果实木质化败坏中的作用机理提供参考。以‘解放钟’枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.‘Jiefangzhong’）果实为试材,采用硫酸铵盐析、透析和DEAE-纤维柱层析等提取漆酶（EC 1.10.3.2）研究其理化特性,包括温度、pH、抑制物、金属离子对漆酶活性的影响及其底物特性,测定果实贮藏期间pH变化。结果表明,漆酶的最适温度为45℃,最适pH为4.4,pH为3.2~4.4时酶的稳定性较好。金属离子Cu2+、K+对漆酶有激活作用,而Ag+、Fe2+、Fe3+起抑制作用。EDTA和L-半胱氨酸抑制物对漆酶均有抑制作用,以L-半胱氨酸抑制作用最强。枇杷果肉漆酶以2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（简称ABTS）为底物的Km值为0.00512 mol/L。     

一株源于红树林土壤芽孢杆菌的鉴定 及其蛋白酶学性质研究

从湛江红树林土壤中分离出一株产蛋白酶的芽孢杆菌,通过细菌形态观察、生理生化试验及16S rRNA 基因序列进行分类鉴定,并研究了温度、pH 值、金属离子、EDTA 和吐温80 等因素对该菌株发酵产蛋白酶的酶学性 质的影响。结果表明,该菌株为解淀粉芽孢杆菌,命名为解淀粉芽孢杆菌y-6（Bacillus amyloliquefaciens strain y-6）; 该菌株产生蛋白酶的最适温度为55益,最适pH 为7.0~7.5,40益时,酶活性稳定,保温3 h仍有95%以上的相对酶活 力,pH 为5.5~11 时,酶活性稳定,相对酶活力均在90%以上;Ca2+、Zn2+和吐温80 对蛋白酶有一定的激活作用,Mn2+、 Fe3+、Cu2+及EDTA 对酶有一定的抑制作用,其中EDTA 对酶的抑制作用最强。     

金枪鱼肉降解用高产蛋白酶菌株的筛选及鉴定

采用透明圈法从舟山普陀白山土壤中筛选出3株能分泌胞外蛋白酶的菌株,并对蛋白酶活力最高的菌株进行分子鉴定及最适宜生长条件分析。选择福林酚试剂法测定其蛋白酶活力,对蛋白酶活力最高的菌株进行16S r RNA基因测序,用MEGA软件构建系统发育树,并考察其接种量、温度、时间对该菌株产酶活力的影响。结果表明,zjoub-1菌为高产蛋白酶菌属,并确定为枯草芽孢杆菌。该菌株用于金枪鱼暗色肉发酵时的最适宜条件为接种量2%、pH 7.4、温度37℃、时间48 h。在此生长条件下,菌株产蛋白酶活力最高,为49.21 U/m L,能够有效地降解金枪鱼暗色肉。