南极磷虾羧肽酶A的分离纯化及其酶学性质分析

[目的]建立南极磷虾羧肽酶A的分离纯化方法,并研究分析其酶学性质,为南极磷虾羧肽酶A的开发及应用打下基础.[方法]南极磷虾粗酶液经硫酸铵分级沉淀、HiTrap DEAE FF阴离子交换柱层析和SEC 70凝胶过滤柱层析,纯化得到的羧肽酶A,以SDS-PAGE分析其分子量;通过分析酶系反应温度、pH、金属离子、抑制剂对南极磷虾羧肽酶A活力的影响,明确其酶学性质和酶促动力学.[结果]南极磷虾羧肽酶A分子量为75.0 kD,其最适温度30℃,最适pH 8.0.Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ni2+对南极磷虾羧肽酶A有显著的激活作用(P<0.05,下同),且金属离子浓度越高,激活效果越明显;Ca2+、Fe3+、Cu2+和Hg2+对南极磷虾羧肽酶A存在不同程度的抑制作用,以Hg2+的抑制作用最强,Fe3+的抑制作用最弱.金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸(EDTA)、3-苯基丙酸(3-phenylpropionic acid)和1,10-菲罗啉(1,10-phen-athroline)对南极磷虾羧肽酶A活力有显著的抑制作用,且抑制剂浓度越高,抑制效果越明显.[结论]南极磷虾羧肽酶A具有金属蛋白酶特性,可开发成降解酶制剂在食品工业及医药行业中推广应用.     

黑曲霉TH-2蔗糖酶的分离纯化及部分性质研究

实验室保存的菌种黑曲霉TH-2经柠檬酸-磷酸缓冲液抽提,DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,得到电泳纯的蔗糖酶.纯化后的蔗糖酶比活为135.90 U/mg,回收率为37.7%,提纯倍数为20.3倍.测得酶的相对分子质量为1.29×105,最适温度为65℃,最适pH值为4.4.以不同浓度蔗糖为底物测得Km值为23.1 mmol/L.Ag+对其活性有很强的抑制作用,而Zn2+,Cu2+,Mn2+对其有激活作用.     

黑曲霉TH-2蔗糖酶的分离纯化及部分性质研究

实验室保存的菌种黑曲霉TH-2经柠檬酸-磷酸缓冲液抽提,DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,得到电泳纯的蔗糖酶.纯化后的蔗糖酶比活为135.90 U/mg,回收率为37.7%,提纯倍数为20.3倍.测得酶的相对分子质量为1.29×105,最适温度为65℃,最适pH值为4.4.以不同浓度蔗糖为底物测得Km值为23.1 mmol/L Ag+对其活性有很强的抑制作用,而Zn2+,Cu2+,Mn2+对其有激活作用.     

Purification and Characterization of α-galactosidase from Rhizopus sp.A03

根霉(Rhizopus sp.A03)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9％,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa.该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃, 表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/Km值为2.866×104 mol-l/(Ls);水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/(h·mg);水解活性受Fe3+、Cu2+、Mn2+和Hg+等离子的强烈抑制,但Fe2+对酶活性具有显著的激活作用.该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60 min,残余酶活达到了77.4％.     

南极磷虾羧肽酶的分离纯化及酶学性质

南极磷虾生活在极寒环境,其体内特殊的蛋白酶系统是其维持正常新陈代谢的关键因素。羧肽酶是南极磷虾蛋白酶系统中一类主要且关键的蛋白酶,酶学性质研究对其后续基础研究开展及商业利用都具有指导意义。本研究以南极磷虾为原料,采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析,DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析和Sephadex G-100凝胶层析,从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶,SDS-PAGE结果显示其分子量为30 ku。酶学性质研究结果显示:该酶最适温度为30℃;最适pH为8.0。热稳定性较差,即使在4℃下保温超过2 h酶活性会急剧下降。金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)具有激活作用,且激活作用依次增强;而Ca~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)起抑制作用,Cu~(2+)抑制效果最明显。对巯基有修饰作用的抑制剂DTT和β-巯基乙醇对其有抑制作用,推测该酶活性中心存在二硫键;金属蛋白酶抑制剂EDTA和1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用,说明了其具有金属蛋白酶特性;而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液,测得该酶K_m为0.005 9 mg/mL、V_(max)为4.909 1 U/min。     

香樟(Cinnamomum camphora)果实酪氨酸酶的分离纯化及特性分析

[目的]检测并分离香樟果实中的酪氨酸酶。[方法]从香樟成熟果实中分离和纯化出酪氨酸酶,研究该酶的酶活、蛋白质含量、最适pH值、最适温度、动力学特性和稳定性,并分析了不同金属离子、化合物和中药对其酶活的影响。[结果]经分离和纯化,获得43 kD的酪氨酸酶。该酶的最适pH值和最适温度分别为7.5和50℃。以L-DOPA为底物,测得Km和Vmax分别为12.83 mmol/L和180.65U/mg。该酶在pH值4~7和较高温度时均较为稳定。Al3+和Cu2+对该酶活性具有抑制作用,而Zn2+、Mg2+等则有激活作用。250mmol/LEDTA对该酶有激活作用,抗坏血酸和1 mmol/Lβ-巯基乙醇有完全抑制作用。中药女贞对其有强激活作用,乌梅对其抑制作用最明显。[结论]香樟果实中酪氨酸酶同工酶的存在为该酶的纯化带来一定难度。     

脱脂南极磷虾粉中降血糖与抗氧化肽的分离纯化与鉴定

食源性二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV）抑制肽和抗氧化肽分别有助于清除体内自由基和调节机体血糖。为实现脱脂南极磷虾粉的高值化利用,为糖尿病治疗寻找新方法,从脱脂南极磷虾粉酶解产物中制备DPP-IV抑制肽和抗氧化肽。使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶水解脱脂南极磷虾粉,探究时间与水解度、活性、产率的关系,并分离纯化多肽,最后通过分子对接确定抑制作用位点。结果表明,酶解液经超滤、Sephadex G15分离纯化和液相-质谱联用技术鉴定后,得到了4条具有DPP-IV抑制和抗氧化作用的肽,氨基酸序列分别为WPPLSPFRCPR、IPDWFLNRQ、FLWLKKTPLPL和DTVPWFPR。其中IPDWFLNRQ具备较高DPP-IV抑制活性,DPP-IV抑制活性IC50值为（0.616±0.097) mmol/L;WPPLSPFRCPR具有较高的抗氧化活性,DPPH EC50值为(0.0983±0.011) mmol/L,ABTS EC50值为(0.116±0.073) mmol/L。分子对接结果表明这4种肽主要通过氢键与DPP-IV活性中心及其以外的位点相结合,从而达到抑制DPPP-IV活性的作用。本研究基于脱脂南极磷虾粉制备食源性DPP-IV抑制肽和抗氧化肽,以期为南极磷虾粉的开发利用提供理论依据。     

根霉A03α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质初步研究

根霉（Rhizopus sp.A03）发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9%,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃,表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/K_m值为2.866×10⁴ mol-1/（L·s）;水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/（h·mg）;水解活性受Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺和Hg⁺等离子的强烈抑制,但Fe²⁺对酶活性具有显著的激活作用。该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60min,残余酶活达到了77.4%。     

短小芽孢杆菌阿魏酸酯酶的分离纯化及性质研究

通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析,对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)发酵液中的阿魏酸酯酶进行分离纯化,并测定其部分酶学性质。结果表明,阿魏酸酯酶的纯化倍数为5.06,回收率达到14.8%。该酶的相对分子质量约为28.6 ku;最适反应温度为50℃,最适pH为5.8,在40~45℃和pH 5.8~8.2都能保持很高的稳定性。K~+、Co~(2+)、Ca~(2+)和DTT对酶活有明显的促进作用,而Cu~(2+)、乙醇和苯甲基磺酰氟严重抑制了其酶活。以阿魏酸甲酯为底物,测得Km为0.25 mmol/L,Vmax为6.27 U/(min·mg)。     

日本鳗鲡肠道蛋白酶的分离纯化及其酶学性质研究

【目的】从日本鳗鲡(Anguilla japonica)肠道中分离纯化蛋白酶并分析其酶学性质,为日本鳗鲡饲料的科学研制提供理论依据。【方法】通过硫酸铵沉淀分级分离及Sephadex G-100和Sephadex G-75两级凝胶柱层析纯化日本鳗鲡肠道蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE鉴定蛋白酶纯度和亚基分子质量,利用凝胶层析法测定酶的分子质量,用等电聚焦电泳法测定酶的等电点,并研究以酪蛋白为底物时蛋白酶催化反应的动力学参数及pH、温度、金属离子和修饰剂对蛋白酶活力的影响。【结果】日本鳗鲡肠道蛋白酶亚基分子质量为65.3ku,酶分子质量为260.3ku,等电点为8.23;该蛋白酶的最适pH为8.2,最适温度为55℃,米氏常数(Km)为4.832mg/mL,最大反应速度(Vmax)为0.269U/min。日本鳗鲡肠道蛋白酶在pH为6.6~9.0时表现稳定,在20~55℃时具有较好的热稳定性,在60℃以上稳定性迅速下降。Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和Hg2+对日本鳗鲡肠道蛋白酶的活力表现出不同程度的抑制作用,其中以Hg2+的抑制作用最强,1 mmol/L Hg2+可使酶活力丧失87.63%;而Fe2+有激活作用,5mmol/L Fe2+可使酶活力提高134.53%。修饰剂EDTA、对氯汞苯甲酸(pCMB)和Cys对酶活力没有影响,苯甲酰基磺酰氟(PMSF)和二硫苏糖醇(DTT)对酶活力则有不同程度的抑制作用。【结论】日本鳗鲡肠道蛋白酶由4条相同肽链组成,属于丝氨酸蛋白酶类,二硫键是维持其活性所必需的,酶活力易受环境中酸碱度、温度和金属离子调控。     

米糠过氧化物酶的酶学性质研究

以邻苯二胺、过氧化氢为底物,采用分光光度计测定氧化产物的方法对米糠过氧化物酶的性质进行了研究,结果表明:过氧化物酶活性在35℃达到最大值,最适pH值为6.5,在反应5 min时,达到酶的最大反应活度;金属离子钾、钠、钙对过氧化物酶有不同程度的抑制作用,抑制作用表现为钙离子>钠离子>钾离子,木瓜蛋白酶和抗坏血酸在不同范围下呈现出不同的抑制和促进作用。由Linewear-Burk方程,得到过氧化氢Vmax=9.708×10-3△A/min,Km=15.135×10-3mol/L;邻苯二胺的Vmax=12.346×10-3△A/min,Km=19.247×10-3mol/L。     

芽孢杆菌L4菌株角蛋白酶的酶学性质研究

采用室内实验方法,对芽胞杆菌L_4菌株产生的角蛋白酶进行了系列的酶学性质研究.结果表明,以角蛋白溶液为底物时该酶的最适酶促反应温度为40℃,最适酶促反应pH为7.0,其Km值为1.88 mmol·L~(-1),Vmax为2.72×10~(-2)mmol·L~(-1)·s~(-1).利用不同的蛋白酶抑制剂进行酶活性抑制实验,发现该酶受邻啡罗啉和EDTA的抑制,推测该酶可能是一种含Zn~(2+)的金属蛋白酶.微量元素对该酶活力的影响显著,Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶活力有促进作用,高浓度的Fe~(2+)和Cu~(2+)明显抑制角蛋白活力.     

植物酯酶反应活性影响条件研究

研究酶液用量、pH值、温度、乙酸-1-萘酯用量等条件对酶促反应影响以及几种金属离子对酶促反应活性的影响,并建立酶抑制方程。结果表明:酶液用量0.25 mL、乙酸-1-萘酯0.6 mL、pH值6.5、温度38℃为酶促反应的最佳条件。Cu2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Co2+等离子在一定浓度范围内对酶促反应活性具有激活作用,且Cu2+浓度为0.06 mol/L时激活作用最为明显,能提高60.37%。Co2+浓度为0.04 mol/L时次之,能提高51.75%。     

磷对平邑甜茶根系质膜H~+-ATPase活性的调控

用含NaH2PO4浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的营养液处理后,平邑甜茶根系质膜H+-ATPase的活性随着根区磷浓度的升高而升高,并在1.0 mmol/L处达到峰值;该酶的对硝基苯磷酸(PNPP)水解活性也明显升高,其Km值由3.48 mmol/L下降至0.97 mmol/L;同时结合抑制剂试验,钒酸钠对幼苗根系质膜H+-ATPase的抑制效应也得到了加强。     

毛栓菌木聚糖酶理化性质及动力学研究

从威海市玛珈山上获得毛栓菌（Trametes trogii）,在对其产酶条件研究的基础上,主要研究pH、温度、无机离子对毛栓菌木聚糖酶活性和稳定性的影响,以及该酶底物浓度效应和Km值测定。结果表明：在pH 6.81左右酶活性最高,pH在5.60-9.18范围内体现较强的稳定性.最适酶解温度为40℃,酶液在50℃以下有较好的热稳定性,Na^＋、Mn^2＋对木聚糖酶有激活作用,而Cu^2＋、Fe^3＋、Ca^2＋则抑制木聚糖酶活性,表观Km值为1.25×10^-2g·L^-1。     

乳酸片球菌产谷氨酸脱羧酶的相关酶学性质研究

为研究乳酸片球菌谷氨酸脱羧酶（GAD）的性质,采用比色法测其酶活。结果表明：当底物L-MSG的浓度为100 mmol.L-1时,GAD的活力达到最大。GAD的浓度为3.16%,最适温度为37℃,最适pH为5.0,PLP浓度为0.1 mo.lL-1时,GAD酶活力最大。Mg2＋和Mn2＋使GAD活力提高10%左右,KCl...     

黄冠梨果皮多酚氧化酶的酶学特性

[目的]研究黄冠梨果皮中多酚氧化酶(PPO)的酶学特性,为黄冠梨的贮藏保鲜和加工提供理论基础。[方法]采用分光光度法分别测定在不同反应pH值、不同反应温度、不同底物和抑制剂条件下的PPO活性。[结果]该酶的最适温度为25℃,50℃以上PPO活力明显受抑制;最适pH值为6.0;以邻苯二酚为底物时,Km=0.031 7 mol/L;以绿原酸作为底物时,Km=0.018 9 mol/L;在选定的浓度范围内(0.2~1.0 mmol/L),所用抑制剂的抑制能力从强至弱排列为L-Cys>Vc>Na2S2O3>NaHSO3>EDTA-Na2。较高浓度的CaCl2、NaCl也可对黄冠梨果皮PPO产生抑制作用。Cu2+能提高黄冠梨果皮PPO活性。[结论]绿原酸在黄冠梨果皮酶促褐变中的作用值得重视;采取调节pH值、热烫、添加安全抑制剂可以明显控制该PPO活性。     

金属离子对红白锦鲤肠及肝胰脏蛋白酶活性的影响（摘要）（英文）

[目的]研究金属离子对红白锦鲤消化组织蛋白酶活性的影响。[方法]以酶学分析方法研究4种金属离子（Na＋、K＋、Ca2 ＋、Mg2 ＋分别来源于NaCl、KCl、CaCl2.2H2O、MgCl2.6H2O,浓度梯度均设置为25、50、75、100、125、150 mmol/L）对红白锦鲤肝胰脏、前肠、中肠、后肠蛋白酶活性的影响。蛋白酶活性的测定采用福林-酚显色法,用Thermo紫外分光光度计,根据OD680计算蛋白酶活性,以1 min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,记为μg/（min.g）。[结果]在设定的浓度范围内（25 ～150 mmol/L）,4种金属离子对蛋白酶活性影响不同。K＋对肝胰脏和后肠的蛋白酶活性有不同程度的促进作用,其中K＋对中肠表现为低浓度促进,高浓度抑制的作用,对前肠蛋白酶表现为抑制作用;Na＋对肝胰脏、前肠和后肠的蛋白酶表现为不同程度促进作用,对中肠表现为抑制作用。Mg2 ＋、Ca2 ＋对肠及肝胰脏的蛋白酶均表现为不同程度的抑制作用。试验所选用的K＋、Na＋、Mg2 ＋、Ca2 ＋均属矿物元素,其中添加浓度25 mmol/LK＋对锦鲤肠蛋白酶活性促进作用最大;浓度150 mmol/L Na＋显著提高后肠和肝胰脏蛋白酶活性。这些浓度可作为饲料添加剂中的参考用量。Mg2 ＋、Ca2 ＋对锦鲤各消化器官（中肠除外）的抑制作用随浓度的增加蛋白酶活性降低,但考虑该元素系水产动物生长发育所必需,因此可选用低浓度或螯合物进行添加,以提高酶的生物学效价,提高饲料中蛋白的利用率,降低饵料系数,节约蛋白。[结论]该研究可为红白锦鲤消化生理的研究以及配合饲料的开发、优化提供基础数据和理论依据。