适于荧光原位杂交的大薯叶片染色体制片技术

为克服利用根尖制备染色体标本的局限性，拟通过优化酶解去壁低渗法中的材料幼嫩程度、预处理方法以及酶解时间，建立大薯嫩叶染色体制备技术体系。结果表明:取刚展开的大薯嫩叶，用0.002 mol·L?1 8?羟基喹啉于4 ℃下预处理2 h，用3.5%纤维素酶和1.75%的果胶酶混合溶液于37 ℃下解离1 h，能获得较好的大薯染色体制片。最后，以大薯45S rDNA 序列为探针，对有丝分裂间期和中期细胞进行荧光原位杂交检测，杂交信号清晰稳定。本研究建立的适于荧光原位杂交的大薯嫩叶染色体制备技术可为分子细胞遗传学研究提供一种简便实用的细胞学方法。     

花生自身基因组原位杂交分析

利用自身基因组荧光原位杂交技术,对花生(Arachis hypogaea L.)进行自身基因组原位杂交分析.结果显示,杂交信号沿所有染色体的全长分布,染色体着丝粒区、近着丝粒区和部分DAPI深染的区域存在强烈的杂交信号,染色体远端的杂交信号偏弱,染色体上存在少数未观察到杂交信号的DAPI深染区域.花生自身基因组原位杂交存在明显的非均匀染色体杂交带型,这说明基因区成簇分布在小的染色体区域并被重复序列间隔开.     

荧光原位杂交技术及其研究现状

从荧光原位杂交探针的类型、探针的标记方法、探针和染色体的杂交、染色体显带、荧光显微镜检测等方面介绍了荧光原位杂交技术,并对荧光原位杂交技术目前的发展状况进行了阐述.     

原位杂交技术与细胞遗传图的构建

原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一,本文对其最新研究进展进行综述.核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交;根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA杂交.原位杂交的探针可以是同位素的探针,用放射自显影来检测;也可以是非同位素的探针,通过荧光或酶法予以检测.细胞遗传图综合了来自遗传图和细胞学图两方面的信息,它既能反映基因或DNA标记之间在染色体上的真实距离,又能显示它们与染色体的细胞学结构间确切的位置关系.构建植物细胞遗传图的宗旨是将遗传图上的诸多标记与其在染色体的具体位置联系起来,利用荧光原位杂交(FISH)直接把DNA序列定位到染色体上.     

复制缺陷型慢病毒载体法高效制作转基因家禽

基于慢病毒的第三代复制缺陷型载体由于可侵染分化及未分化细胞，在细胞增殖、分化中没有转录沉默现象，且高效整合，具有高安全性，因而倍受关注。在我们以绿色荧光蛋白（GFP）为标记基因，用慢病毒载体制作转基因鸡，PCR检测显示有67%的个体为转基因阳性，其中2只可从活体体表直接发现较强的绿色荧光信号。     

荧光原位杂交在作物遗传育种研究中的应用

荧光原位杂交是一种原位杂交新技术，具有快速，灵敏，准确和有效等特点，它采用生物示记探针，能够将特定的ＤＮＡ或ＲＮＡ序列直接定位于染色体上，该文就荧光原位杂交技术在作物遗传育种研究中的应用进行综述，主要包括以下方面：１）检测重复ＤＮＡ序列及多拷贝基因家族；２）鉴定异源多倍体物种中的异源染色体或染色体片段；（３）检测和定位低拷贝或单拷贝ＤＮＡ序列。随着一些新技术的发展，ＦＩＳＨ技术将会在作物育种的更多     

原位杂交技术在植物研究中的应用

简述了染色体原位杂交技术最新技术发展 ,阐明了如何利用原位杂交技术通过细胞检测、染色体检测、基因检测来进行植物研究 ,并探讨了该技术的应用前景。     

慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠

【目的】用慢病毒在体内感染精原干细胞,建立转基因动物生产技术平台。【方法】用三质粒慢病毒载体系统转染293T细胞包装慢病毒,转染后裂解细胞,收集携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒。将慢病毒液注射到小鼠曲细精管,获得F0代小鼠,制备小鼠睾丸组织切片,进行免疫双荧光检测。将F0代小鼠与野生型母鼠交配,获得F1代小鼠,PCR检测F1代是否为转基因小鼠。【结果】通过裂解细胞的方法成功制得慢病毒,将其注射到小鼠曲细精管,获得了10只F0代小鼠,经免疫双荧光检测,发现慢病毒可在活体上感染精原干细胞。8只F0代小鼠与野生型母鼠交配后共获得了41只F1代小鼠,经PCR检测,21只携带慢病毒基因片段,转基成功率为51.22%,表明慢病毒介导的基因改造是可遗传的。【结论】建立了一种操作简单、花费少、易于实施的慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠的技术体系,该技术也可以推广到其他动物上,对于加速功能基因鉴定、疾病模型构建和家畜转基因育种等领域的研究有促进作用。     

巴西橡胶树热研7-33-97品种45S rDNA的FISH分析及定位

以小麦的45S rDNA为探针,采用荧光原位杂交技术对巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)热研7-33-97的有丝分裂细胞进行了检测,结果发现,不同时期细胞内均能观察到4个信号位点,且这4个信号的大小和强弱存在差异。核型分析结果表明,这4个信号位点被分别定位在6号和7号染色体上,其中,信号较小较弱的1个位点位于6号染色体的1条同源染色体次缢痕处,信号较大较强的位点位于6号染色体的另1条同源染色体的次缢痕及随体处,其余的信号位点位于7号1对同源染色体的次缢痕及随体处,信号大小和强度介于前两者之间。     

奶牛精子SRY基因原位杂交检测方法的建立

Sry基因是Y染色体性别决定基因,采用primer premier 6对SRY基因序列设计引物,以公牛基因组DNA为模板扩增,高效DNA地高辛标记和检测试剂盒制备探针,对X精子(Y精子纯度7％)、Y精子(Y精子纯度93％)和常规精子(Y精子纯度50％)DTT去凝集、蛋白酶K去除鱼精蛋白,杂交.结果表明:在荧光显微镜下可见标本背景清晰,精子头部成蓝色,边界清楚,X精子4.67％ (n =600)有荧光信号,Y精子86.33％(n=600)有荧光信号,常规精子46.17％有荧光信号.实验证明了所选取Sry基因序列为Y精子携带,建立了精子原位杂交方法.     

Genetic and agronomic traits stability of marker-free transgenic wheat plants generated from Agrobacterium-mediated co-transformation in T_2 and T_3 generations

Genetically modified wheat has not been commercially utilized in agriculture largely due to regulatory hurdles associated with traditional transformation methods. Development of marker-free transgenic wheat plants will help to facilitate biosafety evaluation and the eventual environmental release of transgenic wheat varieties. In this study, the marker-free transgenic wheat plants previously obtained by Agrobacterium-mediated co-transformation of double T-DNAs vector were identified by fluorescence in situ hybridization(FISH) in the T_1 generation, and their genetic stability and agronomic traits were analyzed in T_2 and T_3 generations. FISH analysis indicated that the transgene often integrated into a position at the distal region of wheat chromosomes. Furthermore, we show that the GUS transgene was stably inherited in the marker-free transgenic plants in T_1 to T_3 generations. No significant differences in agronomic traits or grain characteristics were observed in T_3 generation, with the exception of a small variation in spike length and grains per spike in a few lines. The selection marker of bar gene was not found in the transgenic plants through T_1 to T_3 generations. The results from this investigation lay a solid foundation for the potential application of the marker-free transgenic wheat plants achieved through the co-transformation of double T-DNAs vector by Agrobacterium in agriculture after biosafty evaluation.     

DNA分子原位杂交在植物分子细胞遗传学研究中的应用

DNA分子原位杂交(in situ hybridization,ISH)是植物分子细胞遗传学研究的重要工具.简要回顾了DNA分子原位杂交的起源和发展,详细综述了基因组原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH)在植物细胞遗传学研究中的应用以及荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)在植物物理作图和染色体识别中的应用.还介绍了Fiber-FISH、BAC-FISH以及Immuno-FISH等新兴技术,最后对FISH技术进行了展望.     

Sry基因探针FISH检测奶牛XY精子纯度

为探讨荧光原位杂交技术（FISH）在评价奶牛精子纯度方面的应用价值，制备地高辛标记Sry基因探针，对分选X、Y精子及常规精子标本进行RNA水平的精子荧光原位杂交分析。结果显示，荧光原位杂交测定分选X、Y精子及常规精子纯度分别为94.6%、93.3%、50.3%，与对应精子纯度比较差异不显著（P>0.05），杂交信号多出现在精子尾部中段。可见：建立的Sry基因探针FISH方法评价奶牛精子纯度鉴定结果准确可靠，为其他精子纯度评价方法提供可靠的技术支持。     

原位聚合酶链反应技术的发展和应用

原位聚合酶链反应（ｉｎｓｉｔｕＰＣＲ）是一项高新生物技术,它不仅可以检测在细胞中微量的ＤＮＡ或者ＲＮＡ,而且可以精确定位,因此在分子病理学、分子生物学、分子遗传学和微生物学等领域都有重要的应用价值。本文根据最新的研究资料,介绍了这项技术的基本原理、分类、主要实验步骤和注意事项,并建议在间接原位聚合酶链反应（ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｎｓｉｔｕＰＣＲ）中用引物原位标记（ＰＲＩＮＳ）技术代替荧光标记原位杂交（ＦＩＳＨ）检测信号。     

苹果细菌人工染色体双色DNA纤维荧光原位杂交体系的建立及应用

【目的】建立苹果DNA纤维荧光原位杂交（Fiber FISH）技术体系,从而为利用该技术确定苹果基因组DNA序列间的位置关系、构建精细物理图谱等方面的应用奠定基础。【方法】以‘Florina’苹果幼叶为试材,通过液氮研磨,尼龙膜过滤和TritonX-100去除叶绿素等步骤提取细胞核。细胞核经碱裂解,采用盖玻片拉伸方法制备DNA纤维。比较细胞核不同裂解时间和在5种不同包被类型的载玻片上DNA纤维拉伸的效果。用碱裂解方法提取来自苹果‘Florina’自交不亲和S9基因座的4个细菌人工染色体（Bacterium Artificial Chromosome）BAC 34G16、 BAC 45M19、BAC 70J19和BAC 69A4。提取的质粒经PEG纯化,用地高辛或生物素标记探针。探针与DNA纤维制片经过80℃变性、37℃杂交2-3 d和洗片,采用“三明治”方法进行信号放大和检测,在荧光显微镜下观察试验结果。【结果】建立了以苹果幼叶为材料,液氮研磨提取细胞核,碱裂解细胞核和盖玻片拉伸制备DNA纤维的试验方法。提取的细胞核纯净、结构完整,细胞核浓度＞5×103个/μL。试验结果表明,细胞核裂解4 min,在多聚赖氨酸包被的载玻片上制备的DNA纤维平直、伸展均匀,纤维量多、细长,效果好。经原位杂交和信号检测,获得了清晰的、具有Fiber FISH典型特征的“念珠状”杂交信号。对已知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 34G16和BAC 45M19进行杂交信号测量和分析,得出BAC 克隆大小（Y,Kb）与信号长度（X,μm）的相关方程为Y=3.47X（R2=0.9215）,其斜率即为该试验技术体系Fiber FISH的分辨率3.47 kb•μm-1。试验对未知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 70J19和BAC 69A4成功地进行了鉴定,它们大小分别为(112.1±18.4)kb和(133.2±16.3 )kb,之间有（90.2±7.3）kb的重叠区域。【结论】建立了以苹果幼叶提取细胞核,制备DNA纤维和原位杂交的方法,获得了高分辨率的苹果DNA纤维原位杂交试验技术体系。     

荧光显微技术在土壤微生物可视化研究中的应用

对近年来荧光显微技术在土壤微生物可视化研究中的应用进行了综述,介绍了荧光显微镜技术、激光共聚焦技术、荧光原位杂交技术,并综合分析了各项技术的优缺点。     

Sexual compatibility of transgenic soybean and different wild soybean populations

The introduction of genetically modified (GM) soybean into farming systems raises great concern that transgenes from GM soybean may flow to endemic wild soybean via pollen. This may increase the weediness of transgenic soybean by increasing the fitness of hybrids under certain conditions and threaten the genetic diversity of wild soybean populations. Although pollen-mediated gene flow between GM crops and wild relatives is dependent on many factors, the sexual compatibility (SC) determined by their genetic backgrounds is the conclusive factor. The considerable genetic variation among wild soybean populations may cause compatibility differences between different wild and cultivated soybeans. Thus, an evaluation of the SC between transgenic soybean and different wild soybeans is essential for assessing the environmental consequences of cultivated soybean–wild soybean transgene flow. The podding and seed sets were assessed after artificial hybridization using transgenic glyphosate-resistant soybean as the paternal parent and 18 wild soybean populations as the maternal parents. Then, the average number of filled seeds produced in 200 flowers (AFS) was calculated for each wild soybean under natural self-pollination as well as under artificial crossing with transgenic soybean. Finally, the index of cross-SC was calculated (ICSC) as the ratio of the AFS of wild soybean artificially crossed with transgenic soybean and the AFS of naturally self-pollinated wild soybean. The results demonstrated that after self-pollination and crossing with transgenic soybean, the average podding rates of 18 wild soybean populations ranged within 96.50–99.50% and 4.92–18.03%, and the average filled seed numbers per pod varied from 1.70 to 2.69 and 0.20 to 0.48, respectively. The results showed that approximately 89% of wild soybeans displayed either medium or higher than medium SC with transgenic soybean (ICSC>1.0%). This implied the high possibility of gene flow via pollen from transgenic soybean to wild soybean.     

高效制备转基因小鼠的优化试验

为了优化转基因小鼠的制备技术,试验着重对注射DNA的制备、高质量受精卵的获得、显微注射、胚胎移植及早期胚胎检测等各步骤中的主要影响因素进行了优化。移植后出生的小鼠经PCR及Southern Blot检测,阳性鼠检出率由1.85%(2/108)增加到23.36%(25/107)。由此说明,通过注射DNA的改良、技术优化以及GFP在转基因动物中的应用,转基因效率可以得到明显提高,为高效制作转基因动物提供基础。     

Bt基因导入形态抗蚜棉研究

野生棉种多茸毛是一种形态抗蚜性状,其抗虫机理在于阻碍害虫特别是刺吸式害虫的取食,对幼虫的移动产生机械障碍作用,对棉蚜、棉叶螨、棉叶蝉、红铃虫等棉花害虫具有抗性。通过远缘杂交方式将野生棉种的多茸毛性状转育到栽培种陆地棉上,采用花粉管通道法将Bt基因导入形态抗蚜棉,获得转Bt基因形态抗虫棉纯合系;对纯合系2种害虫的抗性检测表明,通过转基因技术可以将高抗棉铃虫特性导入到形态抗蚜棉,但转化株系仍然保留了受体材料的抗蚜性状。表明通过远缘杂交与转基因技术可以实现多茸毛抗蚜性状与转基因抗棉铃虫性状的融合,并可有效解决棉花生产上的主要虫害。