精子RNA的研究进展

1精子RNA存在的争论 作为遗传物质的载体，精子的作用仅是将父本的基因组DNA成功地带入到卵子中，所以成熟精子不必含mRNA，这个观点被广泛接受。有关精子中存在RNA的报道，常被解释为有未成熟的精子细胞的存在，或是精子分析样本中混杂有体细胞，或是精子中含有未被支持细胞吸收的胞质小体造成，而胞质小体的存在又通常被认为是精子成熟度低的标志。     

牛精子原位杂交DTT去凝集条件优化

[目的]确定牛精子原位杂交DTT去凝集处理的优化浓度及时同.[方法]牛精子解冻后经密度梯度离心优选并制片,采用0、5、10、20、40、80和100 mmol/L六个DTT浓度以及15、30、45和60 min4个时间段的28个组合进行去凝集处理,Motic Images Advanced 3.2软件测量精子解聚后头部面积.[结果]40 mmol/L DTT处理45min精子头部面积为(52.32±4.68 )μm2,浓度＜ 40 mmol/L的16个处理组及浓度≥40 mmol/L、处理时间＜45 min的6个处理组,精子头部面积小于(52.32±4.68) μm2(p＜ 0.01);浓度＞40 mmol/L、时间≥45 min的5个处理组,精子头部面积与40 mmol/L DTT 45 min组差异不显著(P＞0.05),但精子形态不完整.[结论]40mmol/L DTT 45 min为较优处理组合.     

奶牛精子RNA提取

优选3头公牛细管冻精,采用上游法获得纯化精子,以含体细胞污染的精子作对照,应用离心层析柱方法和Trizol一步法相结合提取总RNA,紫外分光光度计检测总RNA的D260/280值和产量,并对总RNA进行RT-PCR和凝胶电泳。结果显示,纯化的牛精子中不含体细胞,奶牛细管精液总RNA在2 h内完成提取,D260/280值为1.80,大于200 bp的总RNA产量为0.92 μg/107个精子,精子总RNA进行RT-PCR,电泳后可得到清晰的SRY、LEP和RPS23基因3条带,不含18S rRNA基因条带。结果表明,离心层析柱法和Trizol一步法相结合可获得高质量的奶牛精子总RNA,且纯度和完整度高,可满足分子生物学研究的要求。     

奶牛精子原位杂交蛋白酶K浓度的优化

[目的]确定奶牛精子原位杂交中最佳蛋白酶K浓度。[方法]设置6个蛋白酶K浓度（10、20、30、40、60、80μg/ml）,奶牛精子在37℃消化处理20 min,以精子尾部颈段和中段的存在作为选定最佳蛋白酶K浓度的标准。[结果]30μg/m l蛋白酶K既能有效去除精子蛋白质,又能保持精子的基本形态。[结论]精子原位杂交的最佳蛋白酶K浓度是30μg/ml。     

Sry基因探针FISH检测奶牛XY精子纯度

为探讨荧光原位杂交技术（FISH）在评价奶牛精子纯度方面的应用价值，制备地高辛标记Sry基因探针，对分选X、Y精子及常规精子标本进行RNA水平的精子荧光原位杂交分析。结果显示，荧光原位杂交测定分选X、Y精子及常规精子纯度分别为94.6%、93.3%、50.3%，与对应精子纯度比较差异不显著（P>0.05），杂交信号多出现在精子尾部中段。可见：建立的Sry基因探针FISH方法评价奶牛精子纯度鉴定结果准确可靠，为其他精子纯度评价方法提供可靠的技术支持。