牛线粒体CYTB基因的序列分析及进化关系

对CYTB基因全长1140bp序列进行分析的结果表明，10个品种的20条CYTB碱基序列中共发现10种单倍型，黄牛中单倍型较少．共检测到98个变异位点，未发现插入和缺失，牦牛和黄牛除了异亮氨酸以外有着相同的密码子偏好．将核酸序列转换成氨基酸序列后，黄牛表现的遗传差异更小，18个个体分享5种氨基酸序列单倍型，共有6个氨基酸突变位点，8个突变氨基酸．     

中国3个牛种cytb基因多态性及其系统发育研究

基于mtDNA cyt b基因全长序列,对中国黄牛、牦牛和水牛的遗传多态性和系统发育关系进行了分析。结果表明,中国黄牛、牦牛和水牛cyt b基因序列中碱基A和T的含量均比较高,A T的平均含量分别为56.6%,58.2%和56.0%。黄牛在cyt b基因全长序列具有较丰富的核苷酸多样性(Pi=0.016 84),水牛的核苷酸多样性相对贫乏(Pi=0.003 51),牦牛的核苷酸多样性介于二者之间(Pi=0.012 28)。中国黄牛与牦牛和欧洲野牛之间的亲缘关系相对较近,而与水牛间的亲缘关系则相对较远,黄牛有普通牛和瘤牛2个母系起源;中国牦牛和斑腾牛以及羯牛的亲缘关系相对较近;中国水牛和沼泽型水牛具有较近的亲缘关系,也可能有2个或者2个以上的母系起源。     

中国3个牛种cyt b基因多态性及其系统发育研究

基于mtDNA cyt b基因全长序列,对中国黄牛、牦牛和水牛的遗传多态性和系统发育关系进行了分析。结果表明,中国黄牛、牦牛和水牛cyt b基因序列中碱基A和T的含量均比较高,A+T的平均含量分别为56.6%,58.2%和56.0%。黄牛在cyt b基因全长序列具有较丰富的核苷酸多样性(Pi=0.016 84),水牛的核苷酸多样性相对贫乏(Pi=0.003 51),牦牛的核苷酸多样性介于二者之间(Pi=0.012 28)。中国黄牛与牦牛和欧洲野牛之间的亲缘关系相对较近,而与水牛间的亲缘关系则相对较远,黄牛有普通牛和瘤牛2个母系起源;中国牦牛和斑腾牛以及羯牛的亲缘关系相对较近;中国水牛和沼泽型水牛具有较近的亲缘关系,也可能有2个或者2个以上的母系起源。     

牛亚科4个群体MHC-DRB3.2座位酶切多样性分析

采用限制性内切酶HaeⅢ、BstYⅠ分别对鲁西黄牛、渤海黑牛、盱眙水牛和中国荷斯坦奶牛MHC-DRB3.2基因的半巢式PCR产物进行酶切.结果表明:4个群体均在HaeⅢ酶切位点上表现多碱基突变,盱眙水牛等位基因数少于其他3个群体;鲁西黄牛、渤海黑牛和中国荷斯坦奶牛在BstYⅠ酶切位点上表现多碱基突变,而盱眙水牛未检测到突变;x2适合性检测表明鲁西黄牛、盱眙水牛2个群体在Hae Ⅲ酶切位点上碱基突变偏离Hardy-Weinberg平衡状态,中国荷斯坦奶牛在BstYⅠ酶切位点上碱基突变也偏离Hardr-Weinberg平衡状态,而鲁西黄牛和渤海黑牛在BstyⅠ酶切位点碱基突变已经或基本接近Hardy-Weinberg平衡;根据DA遗传距离和Roger遗传距离的NJ法和UPGMA法对4个群体进行亲缘关系聚类,鲁西黄牛和渤海黑牛首先聚为一类,其次是中国荷斯坦奶牛,盱眙水牛最后加入.结果显示:用牛的PCR-RFLP体系可进行水牛的MHC-DRB3.2基因的研究;盱眙水牛MHC-DRB3.2基因的突变率低于黄牛.     

MHC-DRB3.2基因在牛亚科3个群体中的PCR-RFLP多态性分析

采用限制性内切酶HaeⅢ、BstY1分别对鲁西黄牛、渤海黑牛和山区水牛MHC—DRB3．2基因的Semi—Nest PCR产物进行酶切。结果表明：3个群体均在HaeⅢ酶切位点上表现多碱基突变,山区水牛等位基因数少于前2个群体;鲁西黄牛和渤海黑牛在BstYI酶切位点上表现多碱基突变,而山区水牛未检测到突变;x^2。适合性检验表明,3个群体在HaeⅢ酶切位点上碱基突变均未达到Hardy—Weinberg平衡状态,而鲁西黄牛和渤海黑牛在Bst Y I酶切位点碱基突变已达到或基本接近Hardy—Weinberg平衡。结果提示：用牛的PCR—RFLP体系可进行水牛的MHC—DRB3．2基因的研究;群体规模的急剧下降导致基因频率的失衡;山区水牛MHC—DRB3．2基因的突变率低于黄牛。     

中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛线粒体DNA多态性和系统进化分析

为阐明中国荷斯坦奶牛和鲁西黄牛的线粒体DNA多态性及其起源关系.提取了2个品种牛外周血液中的线粒体DNA(mtDNA),用PCR方法将牛mtDNA全长分为4段进行扩增,并用NlaⅢ、HpaⅡ、BglⅡ等16种限制性内切酶进行酶解消化,分析2个品种牛mtDNA的多态性,最终经7种限制性内切酶片段长度多态性分析,共归纳出4种主要的单倍型.通过对2个品种牛mtDNAD环全序列的聚类分析表明:鲁西黄牛和中国荷斯坦奶牛可能均为混合母系起源,源于欧洲普通牛和印度瘤牛.该研究结果对提高动物体外受精和体细胞核移植效率等生物技术平台有一定的理论指导意义.     

延边牛线粒体DNA D-loop序列多态性研究

对4头延边牛个体与GenBank中4头朝鲜牛个体的线粒体DNA(mtDNA)D环(D-loop区)910bp全序列进行了比较分析。结果发现,8头黄牛个体mtDNAD-loop序列由8种单倍型组成,单倍型比例为100%,表明2个黄牛品种mtDNA遗传多态性很丰富;在4头延边牛D-loop区序列中,共检测到核苷酸多态位点17个,核苷酸变异率为1.87%;在4头朝鲜牛中共检测到核苷酸多态位点10个,核苷酸变异率为1.10%;延边牛和朝鲜牛mtDNAD-loop全序列突变类型均为转换、颠换和插入/缺失,其中以转换为主;序列分析显示朝鲜牛与延边牛的同源性很高,达98.90%～99.67%,表明朝鲜牛和延边牛亲缘关系很近。     

牦牛PIT-1基因第5、6外显子部分序列的克隆测序

利用PCR方法扩增了麦洼牦牛PIT-1基因第5、6外显子的部分序列,扩增片段长度为1 285 bp,克隆到PND-18载体中进行测序,结果牦牛与普通牛的PIT-1基因有97%的同源性,共有28处不同,其中在内含子5的347处有18个碱基的缺失,565处有4个碱基的插入；外显子6有一个碱基突变,并导致氨基酸由普通牛的Thr变为牦牛的Arg。对61头麦洼牦牛和30头九龙牦牛PIT-1基因部分序列进行PCR-RFLP分析,均未检测到多态性。     

用20个微卫星标记研究鲁西黄牛和渤海黑牛的遗传多样性

用20个微卫星座位分析了鲁西黄牛、渤海黑牛及用作参照的秦川牛品种的遗传多样性。3个中国黄牛品种在20个座位的等位基因数为4~25个,平均等位基因数接近9个。各座位等位基因长度与欧洲普通牛相似,但平均等位基因数高于报道的欧洲普通牛和部分中国其它黄牛品种。3个品种在不同座位均发现部分特有基因,以渤海黑牛居多,在3个座位检测到7个特有基因。平均有效等位基因数达到6个以上,平均杂合度接近0.8,平均多态信息含量约为0.85,这几项变异参数在3个品种间没有明显差异,但高于欧洲普通牛群体和报道的中国部分黄牛群体的相应值。结果表明,3个品种在当地生态条件下,经数千年的选育积累了丰富的遗传变异,属宝贵的遗传资源。遗传相似度分析结果显示,渤海黑牛先与秦川牛聚为1类,再与鲁西黄牛聚在一起,引证了鲁西黄牛受瘤牛血统影响较大的结论。     

山东省地方黄牛品种.的遗传多样性研究

测定了山东省地方黄牛品种渤海黑牛和鲁西黄牛19头个体线粒体DNA(mtDNA)控制区(D-loop)的全序列,结合两个品种已报道的16个序列,用Lasergene、Mega 4.0和Dna SP 4.90软件对所得序列进行分析、构建进化树.结果显示:发现了29个单倍型,83个核苷酸多态性位点,转换/颠换比为4.27.山东黄牛主要有两个母系来源:欧洲牛和印度瘤牛,但受欧洲牛的影响更大一些.表明:山东地方黄牛品种具有丰富的遗传多样性和较高的进化潜力.     

中国4个牛种MSTN基因外显子2多态性分析与其系统发生关系研究

[目的]解决牛亚科动物近缘物种的分类归属问题,了解牛亚科各种群遗传多样性。[方法]采用酚-氯仿抽提法从4个中国牛种中提取基因组DNA,对MSTN基因进行PCR扩增和测序,构建系统发育树,探讨4个牛种间MSTN基因外显子2的系统发生关系。[结果]MSTN基因外显子2编码区为372 bp。蒙古牛、牦牛和独龙牛的MSTN基因外显子2具有丰富的多态性。在所测66个样本中存在3个核苷酸多态位点,定义了6种单倍型。雷琼牛、蒙古牛、独龙牛与巴州牦牛享有共同的单倍型。巴州牦牛独自聚成一支,而雷琼牛与一部分独龙牛、大部分蒙古牛和引用瘤牛聚成一支。[结论]蒙古牛、雷琼牛、独龙牛种间存在着基因交流。牦牛与普通牛、瘤牛的分化较明显,比瘤牛与普通牛的亲缘关系要远。     

中国黄牛Y染色体多态性及品种起源演变的探讨

 用G带、C带、RBA带、常规和C带或RBA带连续染色技术研究了中国9个地方黄牛品种的66头人工授精用公牛、41头小公牛和12头母牛的染色体，着重研究了它们Y染色体的多态性。北方的蒙古牛和延边牛是无肩峰牛，具有普通牛核型，其Y染色体分别为亚中和中着丝点。中原地区的秦川牛、晋南牛在每个品种中均发现了亚中、中和近端着丝点Y染色体，而郏县红牛中存在着中和近端着丝点两种形态Y染色体、这几个品种应是由肩峰牛和无肩峰牛长期融合形成的。西镇牛、鲁西牛、南阳牛、温岭高峰牛均具有瘤牛类型的Y染色体，是以瘤牛为基础形成的品种。经RBA带鉴别，西镇牛Y染色体无短臂，为端着丝点染色体，其余3个品种为近端着丝点Y染色体。结合国内有关黄牛染色体研究材料，讨论了中国黄牛的分类和起源。认为中国的无肩峰黄牛除来源于具亚中着丝点Y染色体的蒙古牛之外，还应来源于另一种分布范围很广的，具中着丝点Y染色体的无肩峰牛。鉴于现有的肩峰黄牛品种中Y染色体形态和带型差异，可能古代生存于中国的瘤牛已发生分化。中国黄牛诸品种应由不同类型的无峰牛和肩峰牛经长期选育和杂交而形成的。     

The Genetic Diversity and Phylogenetic Status of Luxi Cattle

A total of 87 individuals of Luxi cattle from Juanchen and Liangshan counties, Shangdong Province, China, were sampled by simple random sampling in typical colony. Twenty-one blood proteins and enzymes loci were detected by polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE） and starch gel electrophoresis （SGE）. In the meantime, the data of 7 loci of 13 cattle populations in China and other countries were collected and phylogeny relationships were studied. The results indicated that 9 out of 21 loci showed polymorphism （42.86%）; the level of genetic variation in Luxi cattle population was relatively high, the mean heterozygosity was 0.1416. The Luxi cattle have a close phylogenetic relationship with the cattle populations of east and south of Asia, and this further confirmed the fact that Luxi cattle were the cross-breed between the Bos taurus and Bos indicus in China, but it is impossible that yellow cattle contained the blood of of Bali.     

鲁西黄牛遗传多样性及其系统地位的研究

 以中心产区简单随机抽样在山东省鄄城县和梁山县共抽取鲁西黄牛87头，用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和水平淀粉凝胶电泳技术检测21个编码血液蛋白（酶）的结构基因座的基因频率，同时引用国内外13个群体7个相同座位的研究资料，进行聚类分析。结果表明，在所检测的21个基因座中，有9个存在多型，多态位点百分比为42.86%，群体内遗传变异水平相对较高，平均杂合度为0.1416；鲁西牛与东南亚牛种亲缘关系较近，证实了鲁西牛是由北方蒙古利亚牛系和南方瘤牛的混血种，但不可能含有巴厘牛的血统。目前应扩大保种群的数量，以维持群体内的遗传多样性。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

黄牛、牦牛和水牛MyoG基因单核苷酸多态性分析

采用PCR-SSCP结合DNA直接测序技术,分析黄牛(鲁西牛、渤海黑牛)、牦牛和水牛肌细胞生成素基因(MyoG)外显子1和5′侧翼部分序列的DNA多态性,旨在揭示中国3个主要家养牛种的群体遗传变异并为开展分子育种提供试验依据。结果表明,鲁西牛和水牛群体存在SSCP多态性。序列分析结果显示,渤海黑牛和牦牛MyoG外显子1和5′侧翼部分序列与GenBank相应序列完全一致。鲁西牛在外显子1发生g.48 G→C颠换,由此形成GG、GC和CC 3种基因型,G、C等位基因频率分别为0.743 7、0.266 4;水牛分化明显,发生6处突变,位于g.-5 A→T颠换导致形成AA和AT 2种基因型,A、T等位基因的频率分别为0.825 0、0.175 0;另外5处突变发生在外显子1序列中,其中g.210 T→C颠换是水牛特异性的限制性酶切位点。所有突变均发生在三联体密码子的第3位,且均为同义替代。编码氨基酸在4个牛群体间完全一致。推测鲁西牛MyoG基因外显子1的g.48 G→C突变可能是一个与生长发育性状存在一定相关性的潜在SNP位点。     

牦牛JHDM2A基因的克隆测序及其生物信息学分析

利用RT-PCR克隆技术对牦牛JHDM2A基因进行cDNA克隆测序,并用生物信息学软件分析该基因的编码区序列、蛋白结构及进化关系。结果表明:①牦牛JHDM2A基因cDNA序列大小为4 605bp,其中CDS区序列3 969bp,编码氨基酸1 323个。牦牛JHDM2A基因与人、小鼠、褐鼠、原鸡等物种该基因序列比对,一致性分别为90.3%、86.9%、86.3%、69.9%,在物种间具有较高的一致性。②牦牛的JHDM2A蛋白存在JMJC结构域,属于JMJD家族的一员,该蛋白是一种弱碱性、无跨膜结构的游离蛋白,不定位于细胞的任何部位,进化速度慢、保守性强。以上结果为进一步从分子水平上了解牦牛JHDM2A基因和JHDM2A蛋白的结构、功能提供了理论基础。     

猪Hepcidin基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术从猪肝脏总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列,将该序列及其推导的氨基酸序列与其它17个已知物种的相应序列进行同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,克隆得到的Hepcidin基因cDNA序列长278 bp,编码82个氨基酸,预测的蛋白分子质量和等电点分别为8.76 ku和9.06;与已知牛的Hepcidin序列同源性最高,达81.71%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为今后阐明Hepeidin基因表达特性、表达产物理化性质、抗菌活性及其相关功能等奠定基础。     

牦牛乳酸脱氢酶-1两种遗传变异体的纯化及酶学特性比较

 【目的】从乳酸脱氢酶（LDH）水平上探索牦牛(Bos grunniens)低氧适应性分子机制。【方法】利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析牦牛组织中LDH同工酶谱;用比色法测定牦牛、黄牛和水牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力;采用染料亲和层析和DEAE-Sephadex离子交换层析从牦牛心肌组织中纯化LDH1（由4个H亚基组成）的2种遗传变异体,进行酶学性质的比较。【结果】电泳方法检测发现牦牛LDH1存在2种遗传变异体,根据电泳迁移率分别命名为快型和慢型（LDH1-F和LDH1-S）。获得纯化的牦牛LDH1-F和LDH1-S,比活力分别为21.4 U?mg-1蛋白和17.8 U?mg-1蛋白,在SDS-PAGE和PAGE上均显示1条区带。2种变异体以NADH为底物的米氏常数（Km）值差异不大,均显著高于普通牛的LDH1;以丙酮酸钠为底物的Km值LDH1-F小于LDH1-S。试验进一步比较了携带不同LDH1变异体的牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力和各种同工酶谱,未见显著差异,而牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力显著或极显著低于黄牛和水牛。【结论】牦牛LDH1 2种遗传变异体的Km值存在差异,且Km(NADH)高于普通牛;牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力低于普通牛。