三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的克隆及序列分析

以藜科植物山菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的保守区设计引物，通过RT-PCR技术，从三角叶滨藜cDNA中分离了两个BADH基因片段BADH3和BADH5，并利用巢式PCR、cRACE以及3′-RACE获得全长BADH3。测序结果表明，BADH3和BADH5之间的核苷酸同源性为81％，其推测的氨基酸序列同源性80％。全长BADH3核苷酸序列长1815bp，79～1578bp为一个开放阅读框架，推测的氨基酸序列全长500个氨基酸残基，相对分子质量为54700，pI为5．5。其核苷酸序列和推测的氨基酸序列与山菠菜同源性分别为95％和93％。由三角叶滨藜3′端部分BADH基因的克隆gBADH1和gBADH2推测的外显子序列分别与BADH5和BADH3完全一致，且gBADH1和gBADH2的内含子插入位置和大小有较大差异。表明三角叶滨藜BADH基因是一个多基因家族，至少存在2个成员。     

枸杞胆碱单加氧酶基因的克隆与表达分析

根据CenBank中的植物胆碱加氧酶(CMO)基因的同源保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从枸杞中扩增出CMO基因的保守序列,并利用巢式PCR、5'-RACE和3'-RACE获得全长CMO.测序结果表明,CMO全长1540 bp,包含1284 bp长的开放读码框(ORF),编码1个含427氨基酸残基、分子量为48.48 kDa、等电点(pl)为5.97的假定蛋白质.此序列Genbank登录号为FJ514800.mRNA分析表明,CMO基因在枸杞幼苗组织中受高盐胁迫和低温胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在植物抵御非生物胁迫中发挥重要作用.     

新疆野生冰草抗旱功能基因BADH的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆新疆野生冰草抗旱相关基因甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因,为进一步研究其抗旱功能奠定基础.[方法]利用同源克隆法和RACE方法扩增获得新疆草原区强抗旱植物沙生冰草抗旱相关基因BADH,并将其构建到植物表达载体pBI121上.[结果]克隆获得的新疆野生沙生冰草抗旱相关基因BADH全长1 422 bp,编码区序列全长为1 182 bp,GenBank注册号为GU181396.1,并成功构建了植物过表达载体.     

三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因5′侧翼序列的克隆与分析

根据三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)5′端序列设计特异引物,采用反向PCR技术从三角叶滨藜总DNA中扩增并克隆了该基因的5′侧翼区约855bp的片段。距起始密码子ATG77bp处的T碱基为可能的转录起始位点。在-25～-30bp、-260～-265bp、-337～-342bp以及-715～-720bp含有推测的TATA box(TATAAA),在-389～-393bp和-720～-724bp含有推测的CAAT box(CCAAT),以及在-112～-116bp和-397～-401bp含有推测的ABA作用元件CACGT。仅其-178～-1bp区与中亚滨藜BADH基因启动子区高度同源,同源性为90%。该BADH基因5′侧翼区与其它植物BADH基因的启动子区无同源性。     

宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶（LbBADH2）的克隆与序列分析

以宁夏枸杞为试验材料,利用同源克隆技术,设计简并引物,克隆得到一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因.该基因全长cDNA为1 527个碱基,编码508个氨基酸,编码区两侧翼分别具有5＇UTR （47 bp）和3＇UTR（129 bp）.在推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VrlElGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）.进化分析表明,它与番茄甜菜碱醛脱氢酶亲缘关系最近,与其他藜科植物亲缘关系较远.该基因的获得有助于理解枸杞这一盐生植物耐盐机理,为培育新的耐盐枸杞奠定理论基础.     

川芎甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

以川芎(Liqusticum churning Franch Hort)为材料,采用RT-PCR和RACE方法,从新鲜的嫩叶中克隆出甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的cDNA序列。克隆到的cDNA序列全长为2 211 bp,编码一条由508个氨基酸残基组成的多肽,其核酸序列与人参的BADH基因的cDNA序列同源性为86%,对应编码氨基酸序列同源性为91%。将得到的序列提交GenBank,序列号为HM352764。与其他植物BADH的氨基酸序列比对,川芎BADH具有相同功能区域,包括N-端信号肽、底物结合及酶催化位点,因而可以参与甜菜碱的合成反应。对川芎BADH与其他植物BADH的氨基酸序列的进化分析表明,其与五加科人参的同源性较近。     

榛子甜菜碱醛脱氢酶基因BADH的克隆及在越冬过程中的表达特性分析

甜菜碱是高等植物体内一种重要的渗透调节物,甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogen-ase,BADH)是甜菜碱合成的关键酶之一,本文基于Solexa技术对平榛花芽转录组测序结果的分析采用RACE-PCR技术克隆到一个平榛BADH基因,命名为ChBADH(HQ700873)。ChBADH cDNA全长1 691 bp,具有一个1 512 bp的潜在编码区,编码503个氨基酸,预测其蛋白质相对分子量54.7 ku,理论等电点为5.44。Ch-BADH具有BADH家族保守的VSLELGGKSP功能活性位点和特征多肽序列,序列比较和生物信息学分析结果显示ChBADH在保守结构域和其他植物来源的BADH享有高度的一致性。以ACTIN为内参,对ChBADH基因在四个时期平榛的表达模式进行了初步的研究,荧光定量结果表明,ChBADH在寒冬时期被强烈的诱导表达,是非冷适应时期的3.5倍,推测该基因可能与榛子花芽越冬有紧密关系。     

银杏类黄酮糖基转移酶基因片段克隆与分析

根据GenBank中其他植物的类黄酮糖基转移酶基因(UFGT)的保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从银杏中扩增出UFGT基因的部分保守序列,并利用3′-RACE PCR方法,得到了包括3′-末端在内的银杏UFGT基因片段,命名为GbUFGT-3。结果表明:该片段长度为1 064bp,其中3′-UTR长度为314bp、编码区长度为750bp,可编码249个氨基酸,该氨基酸序列具有完整的UFGT特征序列PSPG-box;BLASTp分析及系统进化树分析表明GbUFGT-3确为银杏UFGT基因的序列片段;半定量RT-PCR结果表明,GbUFGT-3是非诱导表达基因,在银杏叶片的整个发育期均有较高水平的表达,不同发育期表达量无差异。GbUFGT-3已被GenBank收录,登录序列号为JN640564.1。     

二色补血草凝集素（Lectin）序列分析及表达

从二色补血草cDNA文库中分离出一个凝集素(Lectin)基因全长cDNA序列.该基因全长977 bp.其中:5′非翻译区(UTR)103 bp,3′非翻译区(UTR)208 bp,开放阅读框(ORF)全长663 bp,编码由221个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为25 kD,理论等电点为8.82.利用实时定量RT-PCT方法进一步研究了二色补血草在植物病原菌(尖孢镰刀菌)侵染条件下不同时间点该基因的表达情况.结果表明,在尖孢镰刀菌胁迫处理的条件下,能诱导Lectin基因在二色补血草的根、叶中表达,说明该基因与植物抗病相关.     

四翅滨藜BADH基因的克隆、序列分析及其原核表达

在构建四翅滨藜(Atriplex canescens)全长cDNA文库中通过随机克隆测序并进行EST分析基础上,得到1个四翅滨藜甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)的cDNA序列,命名为AcBADH。AcBADH cDNA包含1个长度为1 500 bp的完整开放阅读框,编码500个氨基酸,属于ALDH-SF超家族,其核酸序列与中亚滨藜的BADH基因的同源性为98%,对应编码氨基酸序列同源性为99%。将得到的序列提交GenBank(登录号:JF776157)。与其他植物BADH的氨基酸序列比对,AcBADH具有相同功能区域,包括N-端信号肽,底物结合及酶催化位点,因而推测可以参与甜菜碱的合成反应。对AcBADH与其他植物BADH的氨基酸序列的进化分析表明,AcBADH与鞑靼滨藜、中亚滨藜的亲缘关系较近。将AcBADH基因与原核表达载体pET28a连接,进行融合表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子质量约58 kD的蛋白。