草鱼MKLN1基因可变剪接和微卫星序列的多态性

MKLN1基因编码的muskelin蛋白主要通过其羧基端的kelch重复结构域与其它蛋白形成复合物行使功能。通过分析草鱼鳃组织的基因转录谱,发现其中的MKLN1基因存在（CT）₁₅的微卫星序列,通过检测3个不同的草鱼种群,又发现(CT)₉、(CT)₁₀、(CT)₁₁和(CT)₁₃ 4种多态性序列。通过克隆该段MKLN1基因组序列并与斑马鱼和红鳍东方鲀的MKLN1基因组序列比较,发现克隆得到的草鱼基因序列是由一个内含子和两个外显子组成,共编码144个氨基酸。通过进一步调查不同组织该基因的转录本,发现存在内含子剪接和内含子未被剪接的两个转录本。由于内含子序列未被剪接的转录本在内含子中存在“TGA”终止密码子,导致MKLN1基因翻译提前终止,翻译产物为失去部分kelch结构域的muskelin蛋白。相对于内含子正常剪接的转录本,没有被剪接内含子的转录本在各种组织中的表达量要明显低得多。简而言之,本研究发现了草鱼MKLN1转录本中的微卫星序列是来自未被剪切的内含子,而未被剪切的内含子导致该转录本编码部分kelch结构域缺失的muskelin蛋白。     

草鱼CC趋化因子基因CCL24及其可变剪接

CC趋化因子是一类能够促进动物体内炎症部位的各种白细胞的补充、激活和黏附的趋化性细胞因子家族,是鱼类天然免疫系统的重要组成部分。分析了从草鱼肠道cDNA文库中筛选到的CC趋化因子基因CCL24,并克隆了阅读框区域内的基因组序列。序列分析表明,CCL24基因由4个外显子和3个内含子组成;外显子拼接的序列与CCL24cDNA序列完全一致,编码95个氨基酸,有2个相邻的半胱氨酸(CC),为典型的CC趋化因子亚家族成员。此外,还发现草鱼CCL24基因存在可变剪接现象,第1内含子没有被剪切掉的非正常转录本翻译后可能产生没有CC趋化因子活性的24个氨基酸的短肽,而且这种转录本在精巢、头肾、皮肤、肝胰脏、肠道、肌肉、肾脏等组织均检测到;而正常剪接的CCL24转录本,仅在肾脏和肠道中检测到,且其表达量要明显低于非正常剪接的转录本。     

草鱼CC趋化因子基因CCL24及其可变剪接

CC趋化因子是一类能够促进动物体内炎症部位的各种白细胞的补充、激活和黏附的趋化性细胞因子家族,是鱼类天然免疫系统的重要组成部分。分析了从草鱼肠道cDNA文库中筛选到的CC趋化因子基因CCL24,并克隆了阅读框区域内的基因组序列。序列分析表明,CCL24基因由4个外显子和3个内含子组成;外显子拼接的序列与CCL24cDNA序列完全一致,编码95个氨基酸,有2个相邻的半胱氨酸(CC),为典型的CC趋化因子亚家族成员。此外,还发现草鱼CCL24基因存在可变剪接现象,第1内含子没有被剪切掉的非正常转录本翻译后可能产生没有CC趋化因子活性的24个氨基酸的短肽,而且这种转录本在精巢、头肾、皮肤、肝胰脏、肠道、肌肉、肾脏等组织均检测到;而正常剪接的CCL24转录本,仅在肾脏和肠道中检测到,且其表达量要明显低于非正常剪接的转录本。     

玉米ZmcpSRP54基因可变剪接分析

cpSRP54基因在植物叶绿体发育中发挥重要作用。本研究用生物信息学方法对玉米ZmcpSRP54蛋白进行了进化分析,利用RT-PCR方法对玉米ZmcpSRP54基因全长cDNA进行了克隆,进而对其进行可变剪接分析。结果表明,玉米ZmcpSRP54蛋白与其它7个物种的cpSRP54蛋白有很高的相似性。鉴定到玉米ZmcpSRP54基因25个不同转录本,1个为标准剪接转录本,其它24个为可变剪接转录本。24个可变剪接转录本共使用了17种非标准剪接位点,4种可变剪接方式,主要以可变的3′端位点、可变的5′端位点和外显子跳跃3种可变剪接方式为主。预测出18种不同长度的ORF,编码18种不同长度的多肽。11个多肽其保守结构域氨基酸序列发生部分缺失,6个多肽其保守结构域氨基酸序列发生全部缺失,1个编码全新的多肽。这些结果将为玉米ZmcpSRP54基因的功能研究提供重要信息。     

甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白基因的克隆与结构分析

 【目的】生物素羧基载体蛋白负责将羧基从生物素羧化酶转移到羧基转移酶上，对于长链脂肪酸的从头合成与种子含油量的形成具有十分重要的作用。本研究的目的是从甘蓝型油菜品种基因组DNA中分离生物素羧基载体蛋白（BCCP）基因的全长编码区序列，通过生物信息学分析揭示该基因的结构特征（包括内含子的数量、长度与分布，蛋白质保守区疏水性特征等）和功能关系。【方法】基因克隆采取同源序列法进行。【结果】分离得到的bccp基因全长均为1 600 bp左右，根据其结构特点可以分成3种类型，它们均包含5个内含子。bccp1基因编码的蛋白质具备完整的生物素化功能结构域，是唯一功能完整的基因序列；bccp2和bccp3由于移码突变造成蛋白合成提前终止，翻译的蛋白质均缺少生物素化结构域。【结论】本研究首次从中国冬油菜品种中克隆获得bccp基因的全长序列并揭示了其序列特征，为进一步利用该基因开展含油量的基因调控研究提供了科学依据。     

小麦TaNAC基因基于可变剪切和microRNA的转录后调控分析

【目的】以条锈菌和白粉菌胁迫的普通小麦（Triticum aestivum L.）为研究对象,分析由可变剪切（alternative splicing,AS）形成的TaNAC结构变异转录本,同时分析TaNAC基因的microRNA调控位点,为进一步解析TaNAC基因通过转录后调控参与小麦响应真菌胁迫奠定基础。【方法】普通小麦兼抗种质N9134在被白粉菌和条锈菌分别侵染后,各8个时间点取样并混合,然后从混合样本中克隆得到大量TaNAC转录本。参考中国春小麦基因组注释信息（IWGSC RefSeq v1.1）进行比对,选择由可变剪切形成的TaNAC序列结构变异转录本,分析它们的序列结构特征。利用生物信息学软件和在线工具,对这些TaNAC结构变异转录本编码产物的功能结构域、高级结构、理化性质、亚细胞定位等特征和变异情况进行比对分析。同时,利用洋葱表皮细胞瞬时表达系统验证其中1对TaNAC结构变异转录本的亚细胞定位预测结果,并选取5组TaNAC基因的可变剪切序列结构变异转录本进行酵母转录自激活试验,研究序列结构变异对TaNAC基因转录调控活性的影响。此外,利用miRBase数据库收录的小麦中已报道的miRNAs和TaNAC基因,进行靶基因预测分析,建立小麦TaNAC家族成员与miRNAs的靶向关系。【结果】以条锈菌和白粉菌侵染的普通小麦兼抗种质N9134为材料,克隆得到的TaNAC转录本中的35条序列结构变异转录本由13个TaNAC基因可变剪切形成。通过分析发现,同一TaNAC基因由可变剪切形成的不同结构变异转录本的核酸序列结构存在差异,而且其对应编码产物的功能结构域、高级结构、理化性质和亚细胞定位等方面均会存在差异,同时也会表现出不同的转录调控活性;不同TaNAC基因的可变剪切方式存在差异,而且它们的结构变异转录本及其编码产物在结构特征、理化性质和转录调控活性等方面也均呈现出多样性的特征。通过分析TaNAC基因与其在编码序列区域的靶标tae-miRNAs,发现具有可变剪切转录本的TaNAC基因与tae-miRNA的结合位点均在其非可变剪切区域。【结论】TaNAC基因可以通过可变剪切这种转录后调控方式参与小麦对真菌胁迫的响应;同时发现,调控TaNAC基因的tae-miRNA可以独立于可变剪切这种转录后调控方式行使功能。     

SPEF2基因可变剪切体和功能性SNP鉴定及其与公牛精液性状的相关性研究

为研究牛精子鞭毛2(SPEF2)基因在中国荷斯坦公牛各组织中的表达调控机制及其与精液品质的相关性,利用RTPCR和克隆测序技术分析SPEF2基因的可变剪切体,同时利用PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism)技术对中国荷斯坦公牛群体进行基因型检测分析。结果表明:鉴定到1个新转录本,命名为SPEF2-splice variant(SPEF2-SV),此转录本是从外显子2到外显子5之间缺失459 bp的新序列,预测编码1个含有1 618个氨基酸的蛋白。SPEF2基因的参考转录本在睾丸中高表达,而SPEF2-SV呈现低表达。在SPEF2基因第1内含子(邻近剪切位点附近140 bp)筛选到1个单核苷酸多态(SNP)突变位点(g.11043CT),经ESEfinder 3.0软件预测发现该SNP改变了剪切因子结合蛋白SC35与靶序列的结合,它可能是产生异常转录本的重要原因。此SNP位点与中国荷斯坦公牛精液品质的相关性分析结果表明,其与射精量、精子密度和精子活力无显著相关,而与精子畸形率显著相关(P0.05),其中等位基因对精子畸形的加性效应、显性和替代效应分别是-1.24%、-2.99%、-0.76%。结论:SPEF2基因表达受可变剪切机制的调控,而且其g.11043CT突变位点可作为中国荷斯坦公牛精液品质选择的潜在功能性分子标记。     

棉花GhFAD2-1基因5’UTR内含子的克隆与序列分析

【目的】对棉花~(Δ12)-油酸去饱和酶基因Gh FAD2-1 5'UTR区的内含子进行克隆和序列分析,为研究Gh FAD2-1的表达调控奠定基础。【方法】利用5'RACE技术,克隆Gh FAD2-1的5'UTR序列,结合棉花基因组序列,克隆Gh FAD2-1 5'UTR内含子,并利用PLACE等生物信息学软件对其顺式作用原件进行分析。【结果】棉花A、D基因组的Gh FAD2-1 5'UTR中各含一内含子序列,全长分别为1 103 bp、1 111 bp;Gh FAD2-1成熟mRNA的5'UTR为77bp,转录的起点碱基为T;5'UTR内含子两个剪切位点分别AA-GG、CA-GC。该内含子包括一些典型的与光响应相关的作用元件,以及与激素和胁迫因素相关的应答元件等。【结论】克隆获得了棉花A、D基因组的Gh FAD2-1基因5'UTR内含子序列;明确其转录的起点碱基及5'UTR内含子的剪切位点,为进一步在分子水平上研究Gh FAD2-1功能及其表达调控规律,为植物的遗传改良奠定了基础。     

日本结缕草耐盐基因ZjbHLH106的克隆及序列分析

bHLH106隶属于Basic helix-loop-helix(bHLH)超家族成员,是一类耐盐相关的转录因子。以日本结缕草为研究对象,通过将拟南芥AtbHLH106与日本结缕草基因组的同源序列比对,鉴定到了日本结缕草ZjbHLH106基因(Zjn＿sc00014.1.g08160.1.sm.mk),利用RT-PCR法,从日本结缕草中克隆出该基因序列。结果显示,ZjbHLH106基因编码区(CDS)的长度为747 bp,有2个外显子和1个内含子;蛋白序列包含了1个典型的bHLH结构域;启动子区域包含了多种生物进程相关转录因子靶位点,包括生物胁迫、非生物胁迫、生长素调控等;ZjbHLH106基因响应盐胁迫诱导,参与了结缕草盐胁迫相关的生物学反应。对ZjbHLH106基因的克隆和研究可为日本结缕草耐盐相关的研究提供理论依据。     

一串红全基因组调研及SSR特征分析

【目的】为了制定更好的一串红全基因组denovo测序策略及筛选SSR标记。【方法】利用Illumina测序平台对一串红基因组大小进行测定,通过生物信息学分析对一串红基因组的重复序列、杂合度等基本信息进行了预估,并进行了初步组装,在此基础上对一串红全基因组进行了SSR查找。【结果】(1)一串红全基因组大小预估为841Mbp;(2)一串红基因组杂合度较低,有一定的重复序列;(3)共获得95 982个重复单元长度为1~6碱基及复合型的SSR重复序列,其中单碱基重复的SSR单元最为丰富,共39 903个,占41.6%;其次是二碱基重复类型(24 820个)和复合型(13 281个),所占比例分别为25.9%和13.8%。【结论】为一串红全基因组denovo测序和SSR标记的筛选提供了依据,对于一串红后续的分子水平上的研究及遗传多样性、遗传图谱构建、品种鉴定等提供了应用价值。     

猕猴桃EST序列的SSR信息分析（摘要）

[目的]通过筛查猕猴桃EST数据库中的SSR重复序列,为开发出新型的猕猴桃EST-SSR标记和分子生物学研究奠定理论基础。[方法]从NCBI公共数据库中最新公布的猕猴桃表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）中随机抽取56 400条序列,应用SSRHunter软件查找微卫星（Microsatellite,SSR）重复序列。搜索的标准是：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为7次、5次、4次、4次、3次,包括复合型微卫星。微卫星的重复次数越多,相应的检验出等位基因数目就越多。[结果]从猕猴桃EST序列中获得了7 939条SSR,其中包括二核苷酸重复5 131条（64.63%）,三核苷酸重复1 237条（15.58%）,四核苷酸重复284条（3.58%）,五核苷酸重复397条（5.00%）,六核苷酸重复890条（11.21%）。大约每2.48 kb长度的单一基因序列中即存在1个SSR,即平均7个单一基因中存在1个SSR。在二核苷酸重复序列中,AG/CT共分布4 654条（90.70%）。在三核苷酸中,较为丰富的3种重复基元是ACC/GGT,AAG/CTT和CGC/GCG,共分布817条,它们占三核苷酸重复中各重复基元的66.04%。在其他基元中,还包括AGG/CCT,AGC/GCT,AAC/GTT,ATC/GAT,AGT/ACT,CGA/TCG,AAT/ATT7种重复基元,共420条SSR序列,占33.96%。AGT与CGT重复基元未见分布。[结论]在称猴桃EST序列中,二核苷酸重复序列是最丰富的重复单元,其次为三核苷酸重复和六核苷酸重复。在所获得的SSR重复单元中,AG/CT为优势重复。     

草鱼和赤眼鳟及其正交F1代的肌肉营养特性比较

为比较草鱼和赤眼鳟正交(草鱼(♀)×赤眼鳟(♂))的子一代F1(下文中简称"正交F1")与同龄草鱼、赤眼鳟的肌肉营养特性,评价正交F1肌肉的营养价值,选取18月龄的健康正交F_1、草鱼及赤眼鳟各12尾,采用生化方法分析3种鱼背肌中水分、粗脂肪、粗蛋白和粗灰分的含量以及氨基酸和脂肪酸的组成,并进行氨基酸营养价值评价。结果显示:正交F_1肌肉中的水分含量显著低于草鱼的(P0.05),显著高于赤眼鳟的(P0.05);粗蛋白含量显著高于草鱼的(P0.05),显著低于赤眼鳟的(P0.05);正交F_1肌肉中的总氨基酸(AA)含量、必需氨基酸(EAA)含量和鲜味氨基酸(DAA)含量分别为156.45、62.81、61.32 mg/g,其中AA含量和DAA含量均显著高于草鱼的(P0.05),且低于赤眼鳟的(P0.05);对试验结果进行氨基酸评分(AAS)和化学评分(CS)分析,发现赖氨酸为3种试验鱼共有的评分最高的氨基酸;正交F1不饱和脂肪酸(UFA)占总脂肪酸的67.67%,显著高于赤眼鳟的(P0.05),显著低于草鱼的(P0.05),其ω6族多不饱和脂肪酸与ω3族多不饱和脂肪酸族的比值为5.88。结果表明,正交F_1较草鱼具有更好的肌肉营养品质。     

不同供饵条件下网养草鱼生长效果的初步研究

通过对6种不同供饵条件下网箱养草鱼试验结果的分析,探讨了不同供饵条件对草鱼营养生长特性的影响.结果表明:配方合理的草鱼用膨化饲料加适量青料投喂组网箱草鱼生长效果最明显,每尾是均增重高达12.2081;主蛋白饲料豆饼、棉饼、菜饼按1.00∶1.25∶3.75的比例进行配方较合理;试验网箱鱼肌肉、血液、肝脏的总糖、总脂、总蛋白质含量均高于同规格池塘草鱼的相应指标,肝脏总脂含量虽高但非“脂肪肝”.     

7个茶树全基因组SSR位点的鉴定与特征分析

测序技术的进步有力促进了基因组学的研究进展。近年来，已有7个茶树参考基因组相继发表，但不同基因组间SSR的数量和特征尚不清楚。通过对7个茶树全基因组SSR位点的鉴定和比较分析发现，茶树中二核苷酸重复单元SSR最多，其次是三核苷酸重复单元，所有品种I类SSR均含量均低于II类SSR。品种间SSR数量在391 815至595 417之间变化，全基因组SSR密度则从131.94 Mb^-1到207.66 Mb^-1不等，不同染色体间存在明显差异。与基因组二核苷酸重复最多不同，CDS区SSR密度更低，且以三核苷酸重复单元为主。二核苷酸和三核苷酸重复最多的类型分别为AG/CT和AAT/TTA。同时发现，不同品种基因组间存在丰富的多态性SSR位点。对这些特征的揭示和多态性SSR的鉴定，将为茶树遗传图谱构建、遗传多样性分析和重要性状的遗传机制解析奠定基础并提供支撑。     

Construction and Characterization of Grass Carp （Ctenopharyngodon idellus） Fosmid Library

Grass carp （Ctenopharyngodon idellus） genomic fosmid library cotaining 129 014 clones was constructed and characterized from one diploid grass carp. The average insert size of the fosmid library was determined to be 35 kb by pulsed field gel electrophoresis, which is 4.1-fold coverage of the grass carp genome. To demonstrate the probability of picking the functional genes from the library, eleven functional genes were screened by three-dimensional PCR technique. The number of positive clones of these genes was from 1 to 6. So, this library may screen any useful genes from grass carp. This grass carp genome fosmid library will be integrated in the presently ongoing efforts to determine the sequence of the grass carp genome.     

疫苗与免疫增强剂在网栏草鱼养殖中的应用研究

本试验分年度在同一开放性网栏精养水域进行。分析发现,接种了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)"四联"疫苗的试验组Ⅲ、组Ⅱ的发病率较未接种疫苗的对照组Ⅰ低,且差异显著,且它们的成活率比对照组Ⅰ分别高37.24%、25.06%;保健费开支上来分析,试验Ⅰ组>Ⅱ组>Ⅲ组。试验结果表明:接种草鱼"四联"疫苗与内服免疫增强剂相结合,可有效地提高草鱼对"四病"的抵御能力,是经济且能行之有效地提高草鱼成活率、单位面积产量及养殖效益的有力措施之一。     

草鱼、鲤、鲢、鱅和尼罗非鲫淀粉酶的比较研究

草鱼、鲤、鲢、鳙的肝胰脏和肠淀粒酶的最适pH值分别为6.4和6.4,6.4和6.4,7.2和6.8,7.2和6.8。草鱼、鲤和尼罗非鲫的肝胰脏淀粉酶活性明显高于肠淀粉酶(P<0.025),而鲢和鳙的肝胰脏淀粉酶活性明显比肠的低(P<0.05)。尼罗非鲫胃淀粉酶活性明显比肝胰脏和肠的低(P<0.005)。5种鱼的肝胰脏淀粉酶活性由高到低的顺序为:草鱼、鲤>尼罗非鲫>鲢>鳙。草鱼和鲤肝胰脏淀粉酶活性分别是尼罗非鲫、鲢、鳙的2.6和7倍。肠淀粉酶活性由高到低的顺序为:尼罗非鲫>草鱼>鲤>鲢>鳙。尼罗非鲫肠淀粉酶活性分别为草鱼、鲤、鲢、鳙的1.11、1.72、1.93、2.41倍。草鱼和鲤肠淀粉酶活性由前肠向后肠逐渐升高,鲢、鳙和尼罗非鲫中肠淀粉酶活性略高于前肠和后肠。     

草鱼点状产气单胞菌单克隆抗体的制备与双抗原夹心ELISA法的建立

为了建立一种快速、准确能早期检测草鱼肠炎病原菌的方法,以患病草鱼为材料,制备点状产气单胞菌单克隆抗体(McAb),并鉴定其特异性和抗原表位;采用过碘酸钠方法,以辣根过氧化物酶标记单抗,用试管凝集试验测定其活性;建立点状产气单胞菌McAb的双抗原夹心ELISA检测方法,确定包被单抗和酶标单抗的浓度,并测定其灵敏度和特异性。结果:1)获得了2株特异性强和抗原表位不同的单抗,其ELISA效价为1∶16 000。2)辣根过氧化物酶标记的抗体活性为1∶640。3)建立了包被抗体稀释度为1∶800、酶标抗体稀释度为1∶1 600的双抗原夹心ELISA检测方法,该方法与点状产气单胞菌呈强阳性反应,与近似菌无交叉反应,灵敏性为7×103cfu/mL。结论:制备的点状产气单胞菌McAb的效价高、特异性强;建立的双抗原夹心ELISA方法操作简单、灵敏度高、特异性强,可应用于草鱼肠炎病原体的早期快速检测。     

高效氯氰菊酯对草鱼血清溶菌酶活性的影响

[目的]在生理生化水平上研究高效氯氰菊酯对草鱼健康的影响。[方法]以同批繁殖、同池培育、体色正常、体重85~115 g、体长12~20 cm的健康草鱼为试材,用不同浓度（0、0.5、1.0、3.0、5.0μg/L）高效氯氰菊酯对其进行暴露处理,研究处理1、5、12 d后草鱼溶菌酶（LSZ）活性的变化。[结果]高效氯氰菊酯浓度与草鱼LSZ活性存在时间—效应关系。暴露1 d时,各处理组草鱼LSZ活性显著上升（P〈0.05） 暴露5 d时,各处理组草鱼LSZ活性无显著变化（P〉0.05） 暴露12 d时,各处理组草鱼LSZ活性显著下降（P〈0.05）。[结论]高效氯氰菊酯对草鱼具有明显的毒害作用。