植物种子油体及相关蛋白研究综述

三酰甘油酯在称为油体的不连续亚细胞器中累积．是植物种子主要的碳源和化学能储备．就油体的结构．油体表面相关蛋白和油体的合成降解等方面的研究进展进行了综述．     

5种植物油体性质的比较

【目的】对5种植物油体的大小、结构及稳定性进行考察,为选择优质的植物油体奠定基础。【方法】利用PBS作为缓冲液,采用梯度离心法,提取水稻、亚麻芥、黄豆、黑豆和红花5种植物的油体,对这5种油体的外观进行观察;在倒置显微镜(10倍目镜×40倍物镜)下对5种植物油体的显微结构进行考察;用Mastersizer 2000激光粒度仪测定5种植物油体的粒径,同时比较于4℃放置15d后5种油体的粒径变化情况;通过SDS-PAGE电泳明确5种植物油体蛋白的分布情况。【结果】与其他植物油体相比,红花油体色泽洁白、透亮,分布均匀,粒径呈单一峰型,且峰型平滑。红花油体粒径为0.4~11.0μm,多数集中在1.75~2.05μm,水稻、亚麻芥、黄豆、黑豆油体粒径分别为0.5~12.0,0.3~11.0,0.4~13.0,0.4~13.0μm。在4℃放置15d后,5种植物油体的粒径增大,油体中均有杂峰出现,峰型不规则。SDS-PAGE电泳检测结果显示,5种植物油体相关蛋白主要分布在20.1~44.3ku。【结论】红花油体较其他植物油体结构规则,分散均匀,应用前景广阔。     

大豆24 kDa油体蛋白基因在大肠杆菌中的表达

 分别构建了含全长大豆24 kDa油体蛋白基因、与大肠杆菌热敏毒素B亚基和定居因子CS6 B亚基基因以串联方式融合的全长大豆24 kDa油体蛋白基因、缺失N端74个氨基酸编码序列的油体蛋白基因及缺失C端152个氨基酸编码序列油体蛋白基因等4个大肠杆菌表达载体。除N端缺失的油体蛋白基因外,其它3个载体的IPTG诱导表达产物对E.coli生长表现出明显的抑制作用,菌液浓度与对照菌株相比,至少降低了3倍;而N端缺失了222个编码核苷酸的油体蛋白基因则对宿主细菌细胞的生长繁殖不再表现有任何毒性。进一步通过SDS-PAGE和Western印迹反应检测各表达载体的IPTG诱导表达产物时发现,仅有N端缺失的24 kDa油体蛋白基因片段在宿主细胞BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中有重组油体蛋白积累。     

油体蛋白与人成骨蛋白-1基因融合植物表达载体的构建及融合蛋白性质预测

克隆大豆油体蛋白特异启动子及油体蛋白基因的全长序列,利用连接PCR的方法,通过一个肠肽酶位点将人成骨蛋白成熟肽编码序列连接到油体蛋白基因3'端并克隆到表达载体pCAMBIA1302中,构建"油体蛋白-肠肽酶-人成骨蛋白"植物表达载体.通过酶切、PCR和测序鉴定,证明表达载体构建成功,将其命名为pCAM-oleo-Bmp7.通过蛋白分析软件DNAstar、SignalP3.0和ProtComp v8.0等软件对重组蛋白的理化性质、二级结构、信号肽和细胞定位进行了分析和预测,证明融合蛋白很好的保留了原来两个蛋白的二级结构和理化性质.     

大豆油体蛋白基因家族的生物信息学分析

油体蛋白(oleosin)是植物中的一类贮藏蛋白,主要作用是维持油体的稳定和贮藏脂质.通过生物信息学方法,对大豆油体蛋白(Glycine max oleosin,Gmole)基因家族中12个成员(编号Gmole1 ～ Gmole 12)的理化性质、结构特点等进行预测分析并建立进化树.结果 表明:12个成员分布在大豆的8条染色体上,没有基因簇的形成;等电点均在5.08～5.18;根据相对分子质量大小,可以分为H型和L型2类;Gmole基因家族成员均具有高度保守的疏水区以及脯氨酸节结构,推测该结构是油体蛋白行使锚定油体功能的主要结构.Gmole基因家族成员氨基酸序列的保守区存在2～3个跨膜结构,推测可形成U型探针的结构锚定油体.Gmole基因家族中Gmole8的三级结构无螺旋,其余成员均为1条单螺旋或双螺旋.聚类分析结果推测Gmole1、Gmole2、Gmole3和Gmole6具有改变大豆种子中的油脂组分含量的功能.     

利用油体蛋白体外重组技术实现牛肠激酶固定化应用

为研究利用油体蛋白体外重组技术实现肠激酶固定化应用的可行性,利用油体蛋白Oleosin、自剪切蛋白Intein和人工合成的牛肠激酶轻链(Enterokinase,EK)cDNA,分别构建表达盒Intein-oleosin-EK和Intein-EK,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达后通过SDS-PAGE和Western-blot检测发现,带有Intein-肠激酶表达盒的阳性菌株中有目的蛋白的表达,而Oleosin-intein-肠激酶融合蛋白表达盒不能在酵母中表达。     

油菜油体的提取方法优化及其稳定性探讨

为了优化油体提取方法,获得较高纯度的油体,以甘蓝型油菜鼎油杂4号种子为试验材料,在漂浮离心、去污剂洗涤、离子洗脱液洗脱等程序的基础上,增加9 mol/L尿素洗脱、正己烷萃取等步骤进行优化,并探讨了理化因素对油体稳定性的影响。结果表明:优化后的方法提高了离体油体的完整性,获得的油体纯度较高。随着Na Cl浓度的增加,油体的稳定性下降;p H值≤3及p H值≥7时油体稳定分布,p H值为4~6时油体稳定性明显下降;温度对油体的影响较小,不同温度下油体分布相对稳定。在此基础上,利用SDS-PAGE对油体蛋白进行分离,获得了较清晰的蛋白质条带。     

oleosin-MT融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定

【目的】获得转金属硫蛋白(MT)基因的拟南芥植株,为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法,扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT。采用冻融法将质粒pOP-oleosin-MT转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化拟南芥,用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株,采用SDS-PAGE法检测oleosin-MT融合蛋白的表达,用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOP-oleosin-MT,融合蛋白oleosin-MT在拟南芥种子中成功表达,其分子质量为26ku;总蛋白质量浓度达到50μg/μL时,超氧阴离子的清除率最高,为58.5%;总蛋白质量浓度为10μg/μL时,羟自由基清除率可达69.7%。【结论】成功获得转MT基因的拟南芥株系,并证明融合蛋白oleosin-MT在拟南芥中具有良好的体外抗氧化活性。     

甘蓝型油菜种子油体蛋白提取及双向电泳分析

[目的]研究不同含油量油菜种子油体蛋白差异表达,为提高油菜含油量提供参考.[方法]分别从高低含油量油菜种子中分离油体,提取油体蛋白,经双向凝胶电泳后,分析油体蛋白质组的二维表达图谱.[结果]仅在高含油量品种种子油体蛋白质组中出现的蛋白点有3个;仅在低含油量油菜品种油体蛋白质组中出现的蛋白点有4个;在两者中均出现、且表达量差异在两倍以上的蛋白点有16个.[结论]采用蛋白质组学技术对不同含油量油菜种子油体蛋白进行比较蛋白质组学研究,是有效研究油菜种子含油量性状的技术手段.     

麻疯树油体钙蛋白JcCale26.8基因克隆及序列分析

[目的]克隆麻疯树(Jatrapha curcas)油体钙蛋白基因JcCale26.8全长cDNA序列，探究麻疯树油体钙蛋白及其基因的结构与功能。[方法]应用RNA-seq测序和PCR技术，从麻疯树种子中克隆获得1个油体钙蛋白家族基因JcCale26.8,并进行测序和序列分析。[结果]JcCale26.8基因序列含有6个外显子和5个内含子，内含子剪接位点符合真核生物基因的GT-AG法则。JcCale26.8基因mRNA序列的完整开放阅读框长717 bp,推测编码由238个氨基酸组成、相对分子量为26.8 kD的油体钙蛋白JcCale26.8。JcCale26.8蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成，并具有油体钙蛋白典型结构特征，与来自蓖麻、川桑和异色山黄麻等多个不同物种的Caleosin蛋白具有较高的同源相似性。[结论]该研究可为麻疯树油体钙蛋白基因的表达调控与功能研究奠定基础。     

花绒穴甲幼虫人工饲料的开发研究

花绒穴甲幼虫人工饲料的成分为蚕蛹粉、干燥酵母、安息香酸盐、山梨酸、蔗糖、蛋白胨、无水柠檬酸、酵母抽取物、墨鱼油（ 或大豆油） 和蒸馏水,经杀菌处理制成．在吸水棉上添加人工饲料,转移接种花绒穴甲小幼虫（ 体长平均６ ．８ ｍ ｍ） 饲养,花绒穴甲幼虫平均取食时间为５ ．１ ｄ,老熟幼虫体长平均为１２ ．３ ｍ ｍ ．经结茧、化蛹的过程,在室内成功培养出花绒穴甲子代成虫．从花绒穴甲子代成虫的羽化率、雌雄鞘翅长等项指标看,用人工饲料饲养和用中间寄主饲养的结果基本相同     

六盘山北侧华北落叶松耗水特性研究

本文以六盘山北侧的华北落叶松(Larixprincipics-rupprchtiiMayr)为研究对象,采用当前国内外较先进的热脉冲式树干边材液流测定技术,从单株水平上探讨了华北落叶松的蒸腾耗水特性以及它们与环境因子之间的影响机理。研究表明:华北落叶松树干液流呈现出较明显的昼夜变化规律和月变化规律。分析影响树干液流因子,提出树干液流回归方程为:液流速率=135.047 765+417.862 158,平均风速-2.737 877,空气相对湿度+0.064 649,太阳辐射强度+5.791 338,土层温度-8.693 540,空气温度-0.002 602,空气相对湿度*太阳辐射强度+0.087 634,空气相对湿度*空气温度-0.000 382,空气温度*太阳辐射强度。     

核桃种子油体发育及不同品种种子子叶油体特征差异分析

【目的】通过观察不同核桃品种种子油体发育过程,分析其成熟期子叶油体特征,旨在寻找核桃种子油体合成的起始时间及发生位置,了解不同品种种子在子叶油体特征上的差异及其与含油率间的关系,加深对新疆早实核桃品种种子细胞超微结构的认识。【方法】以新疆早实核桃品种‘温185’和‘新新2号’为试验材料,采用索式脂肪测定仪检测核桃种子脂肪含量,并运用透射电子显微镜技术观察种子发育进程中细胞器的发育消解及油体发育过程。【结果】花后30 d,核桃种子胚中开始存在单独的细胞,各细胞壁之间界限清晰;单独细胞中开始形成各种细胞器。花后50 d,细胞内的细胞器更为丰富,同时内质网数量不断增多,且以条状为主。花后60 d,内质网两端开始膨胀增厚,零星出现油体,随后种子胚中的油体数量不断增加直至成熟。细胞中的内质网数量于花后90 d开始减少,其余各种细胞器于花后110 d开始消解。花后120 d,细胞被油体和蛋白体填满。子叶细胞中的油体积累滞后于胚中的油体积累,花后60 d才开始形成单独细胞且细胞内已出现各种细胞器,同时子叶细胞中的内质网已开始膨胀增厚。至花后80 d,内质网才开始分泌小泡,形成油体,晚于胚20 d。成熟期核桃种子子叶细胞完全被油体和少量蛋白体充实,油体呈椭球体或不规则多面体,较少为球体,且油体个体间的形态与大小特征存在较大差异。种子含油率相对较高的‘温185’子叶贮藏细胞内油体数量较种子含油率相对较低的‘新新2号’少,但其直径和截面积之和却较大,且在两个品种间分别存在极显著（P＜0.01）和显著（P＜0.05）差异。【结论】核桃种子胚和子叶中的油体主要发生于内质网,在花后60 d开始积累,且子叶中油体的积累滞后于胚,二者不具有同步性。成熟后种子子叶贮藏细胞内油体直径大小和截面积之和是导致‘温185’与‘新新2号’种仁含油率产生差异的内在主要因素。     

植物生物反应器中重组蛋白产量低的原因及对策

包括种子蛋白质贮藏液泡、种子油体、植物悬浮培养细胞、毛状根和叶绿体在内的植物生物反应器作为外源蛋白表达体系尽管已经获得了成功,但迄今为止,在植物生物反应器中仍存在重组蛋白产量低的关键问题。原因可能是重组蛋白在植物表达体系中容易被降解。因此,一种可能的解决方法就是,在转基因植物中将目标蛋白与蛋白酶抑制剂进行共表达,保护其不被降解,从而获得高产量的重组蛋白。     

外源反-10，顺-12共轭亚油酸对体外培养牛乳腺上皮细胞SREBP-1基因表达和蛋白质合成的影响

 【目的】旨在观察反-10,顺-12,共轭亚油酸（t10c12 CLA）对牛乳腺上皮细胞中甾醇调控元件结合蛋白（SREBP-1）基因的表达和蛋白质加工的影响。【方法】本试验使用组织块培养法获得奶牛乳腺上皮细胞,使用不同浓度t10c12 CLA处理乳腺上皮细胞后,用油红染色法检测胞质内的脂滴分布,Trizol法提取细胞总RNA,荧光定量PCR法测定相关基因的表达量,试剂盒法提取细胞总蛋白,进行Western blotting。【结果】随t10c12 CLA添加量的增加,细胞质内甘油三酯的含量逐渐降低。与对照组相比,75、112.5和150 μmol•L-1 t10c12 CLA均对胞质内甘油三酯的积累有显著抑制作用（P＜0.05）。t10c12 CLA 的添加对SREBP-1基因和参与SREBP-1蛋白加工调节基因的表达均无显著性影响（P＞0.05）。根据蛋白质电泳结果推测,t10c12 CLA对SREBP-1前体蛋白的合成并无影响,可能对SREBP-1的加工活化产生抑制作用或对其分解产生促进作用。【结论】t10c12 CLA能抑制胞质内甘油三酯的积累,对SREBP-1基因的表达、蛋白质翻译均无影响,可能影响其加工活化过程和活性蛋白的降解过程。     

江永香柚不同发育时期果皮分泌结构及油体的观察

利用冰冻切片法和组织化学方法对江永香柚不同发育时期果实的果皮进行显微结构、分泌组织和油体的观察,结果发现:授粉后发育至70 d左右的江永香柚果实,其果皮为绿色,外果皮细胞内含大量叶绿体。发育70~150 d的果实其果皮逐渐由绿色转变为黄色,外果皮细胞内叶绿体分布逐渐减少。柚果实外果皮有分泌结构(精油腔)散布在外果皮中,精油腔由两个肾形细胞包围而成,精油腔空隙含有较多的油体。外果皮细胞内有黄色油体的分布,与同属的橙果实外果皮中相比,油体体积大,数量少。     

Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies

A major pathway of eukaryotic messenger RNA (mRNA) turnover begins with deadenylation, followed by decapping and 5' to 3' exonucleolytic decay. We provide evidence that mRNA decapping and 5' to 3' degradation occur in discrete cytoplasmic foci in yeast, which we call processing bodies (P bodies). First, proteins that activate or catalyze decapping are concentrated in P bodies. Second, inhibiting mRNA turnover before decapping leads to loss of P bodies; however, inhibiting turnover at, or after, decapping, increases the abundance and size of P bodies. Finally, mRNA degradation intermediates are localized to P bodies. These results define the flux of mRNAs between polysomes and P bodies as a critical aspect of cytoplasmic mRNA metabolism and a possible site for regulation of mRNA degradation.     

Ultrastructural studies of seed coat and cotyledon during rapeseed maturation

Brassica napus L.(B. napus) is an important oil crop worldwide and it rapidly accumulates oil at late stage of seed maturation. However, little is known about the cellular mechanism of oil accumulation and seed color changes during the late stage of rapeseed development. Here, we analyzed the ultrastructure of seed coat, aleurone and cotyledon in embryos of B. napus from 25 to 70 days after flowering(DAF). The pigments, which were deposited on the cell wall of palisade cells in seed coat, determined dark black color of rapeseed. The chloroplasts degenerated into non-photosynthetic plastids which caused the green cotyledon to turn into yellow. The chloroplasts in aleurone and cotyledon cells respectively degenerated into remnants without inner and outer envelope membranes and ecoplasts with intact inner and outer envelope membranes. From 40 to 70 DAF, there were degraded chloroplasts without thylakoid, oil bodies contacting with plastids or protein bodies, big starch deposits of chloroplasts degrading into small particles then disappearing, and small endoplasmic reticulum(ER) in aleurone and cotyledon cells. Additionally, there were decreases of chlorophyll content and dramatic increases of oil content in rapeseed. These results suggested that the rapid oil accumulation was independent on the NADPH synthesized by photosynthesis of chloroplasts and probably utilized other sources of reductant, such as the oxidative pentose phosphate pathway during the late stage of rapeseed development. The triacylglycerol assembly presumably utilizes the enzymes in the plastid, cytosol or oil body of cotyledon and aleurone cells.     

结构脂质位置选择性酶法合成研究进展

甘油三酯中脂肪酸的组成、碳链长短和双键数目是影响油脂物理化学性质及营养价值的重要因素。脂肪酸在甘油骨架上的位置分布影响结构脂质的生理功能和营养价值。随着脂质功能的开发,结构脂质的研究备受关注。综述了酶法合成结构脂质反应中的脂肪酸酰化位置选择性的影响因素,重点评价了酶促酯交换反应中脂肪酶的催化特异性、反应的环境介质及不同的物理辅助条件等因素对脂肪酸酰化位置选择性的影响,并介绍了甘油三酯中脂肪酸酰化位置的分析检测方法。在此基础上,对酶法合成结构脂质的发展前景进行了展望。