在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白

 【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白，能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性，即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏云金芽胞杆菌片段，本文构建了解离载体pBMB5401，并将上述两个融合基因单独或同时装入解离载体pBMB5401，分别得到重组质粒pBMBcaiiA，pBMB3aiiA和pBMB3439。转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171，随后导入温度敏感型辅助质粒pEG922，重组质粒在整合酶的作用下发生体内重组，消除了抗性基因等非必需片段。【结果】得到3个重组菌BMBcaiiAR，BMB3aiiAR和BMB3439R，在无抗性选择压力下的稳定性均在90%以上。融合蛋白SLH-AiiA及pro3A-AiiA在解离后的重组菌中得到表达，具有对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力。【结论】在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白,可增强其对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力，当同时结合两种方式来表达AiiA蛋白时效果最好。     

生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03的绿色荧光蛋白基因标记及其在柑橘叶片上的定殖

【目的】利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因标记枯草芽孢杆菌生防菌株CQBS03,以研究其在柑橘叶片上的定殖规律。【方法】采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合,并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接构建重组质粒pHY43G,以重组质粒电脉冲转化生防菌株CQBS03,培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析工程菌株GFP的表达情况,然后进行工程菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用叶片喷雾方法接种,平皿稀释分离培养方法测定CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。【结果】重组菌CQBS03-pHY43G高效表达GFP,电泳后出现约29kDa的特异蛋白条带,外源质粒对宿主菌的生长未带来明显不利影响,质粒稳定性实验表明重组质粒pHY43G经30次传代后的稳定性为55%,室内平板抑菌实验结果显示CQBS03-pHY43G对柑橘溃疡病菌生防效果与出发菌株没有明显差异(P0.01),CQBS03-pHY43G菌株在叶片喷雾接种后的0—15d,在柑橘叶片上的数量呈现急剧下降趋势,15d后下降速度稍缓,最后保持相对稳定的较低水平(1.73×103cfu·g-1)。【结论】成功地将gfp转入野生型枯草芽孢杆菌生防菌CQBS03中,构建了荧光标记菌株,初步明确了生防菌的定殖规律。     

谷氨酸棒杆菌中苯酚羟化酶的鉴定及功能研究

【目的】鉴定谷氨酸棒状杆菌中ncgl 2588基因编码的苯酚羟化酶,并验证其在苯酚降解中的作用。【方法】构建谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,比较突变株和野生型菌株利用苯酚能力的差异;同时将ncgl 2588基因克隆到表达质粒pET28a中并转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组菌株原核表达,纯化并测定重组蛋白对苯酚的羟化作用。【结果】成功构建了谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,其在以苯酚为惟一碳源和能源的培养基中不能生长,而野生型谷氨酸棒状杆菌能正常生长;pET28a-ncgl 2588重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达分子质量为73ku的目的蛋白,此蛋白酶活为0.37mmol/(min·mg);在以苯酚为惟一碳源和能源培养谷氨酸棒状杆菌时,苯酚羟化酶得到最高表达,用其他芳香族化合物培养则苯酚羟化酶表达较少;进化树分析发现,谷氨酸棒状杆菌中的苯酚羟化酶与酵母Trichosporon cutaneum中的苯酚羟化酶序列同源性高达43%,远远高于与细菌中苯酚羟化酶的同源性。【结论】谷氨酸棒状杆菌中的ncgl 2588基因编码苯酚羟化酶,且该酶为可诱导酶,在苯酚降解中发挥着重要作用。     

鱼源假单胞菌群体感应信号分子与腐败特性相关关系的研究

 【目的】革兰氏阴性菌通过产生N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）类信号分子，以密度依赖的方式调控某些生理特性的表达，即群体感应（QS）现象。假单胞菌是一种导致蛋白类食品腐败的重要腐败细菌。本研究的目的是确定假单胞菌群体感应信号分子与腐败特性的关系。【方法】利用AHLs检测菌对3株假单胞菌AHLs产生情况进行检测，并通过AHLS降解菌株对所产生的AHLs进行降解。【结果】3株菌均产生AHLs信号分子；菌株FML05-1、FML05-2至少产生两种AHLs分子，二者所产生的主要信号分子是N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯（N-3-oxo-C8-HSL）；FML05-2与降解AHLs的菌株共同培养，发现嗜铁素的产量与蛋白酶活性明显下降。【结论】FML05-2嗜铁素的产生和蛋白酶活性与AHLs有关。为以干扰腐败细菌群体感应为靶点的食品防腐保鲜策略提供研究基础。     

用电激转化法构建杀虫防病荧光假单胞菌

 以广寄主范围质粒Pucp18和Pucp19为载体，用电激转化法，将苏云金杆菌杀虫蛋白基因cryIA（c）片段导入了荧光假单胞菌P303菌株。Southern印迹分析和Western印迹分析分别证实cryIA（c）基因的导入和晶体蛋白在P303中的表达。生物活性测定结果表明，新构建的荧光假单胞工程菌株不仅保持了野生型自然菌株对小麦全蚀病有良好的抑菌活性，而且表现出对小菜蛾、玉米螟有显著的毒杀作用。     

彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的鉴定及其群体感应淬灭的研究

近几年南京种植的彩色马蹄莲软腐病发生严重,从不同品种的彩色马蹄莲不同部位病组织中分离到6个菌株,经形态特征与培养性状比较、生理生化测试、16S rDNA序列分析和致病性测定,鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora,P.c.c).信号分子检测结果表明,分离菌株可产生并释放出N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子.利用PCR技术扩增土壤根癌农杆菌中的attM基因,其编码的AttM解酯酶可以显著降解AHLs,在离体条件下可有效地减弱该病原菌的致病性,这为有效控制彩色马蹄莲细菌性软腐病提供了一种新途径.     

枯草芽孢杆菌 B9601-Y2基因组文库的构建*

 枯草芽孢杆菌B9601-Y₂是一个具有防治植物病害和促进植物生长的专利菌株。本文采用Sau3A I部分酶切的DNA、粘粒载体pLARF-5和Packagene λ DNA包装系统,构建了该菌株基因组文库。文库总量为11 000个克隆,插入片段平均长度为14.77 kb,按99.99%的概率计算,文库覆盖了基因组4.2次。这为该菌株防治病害和促进植物生长机理研究奠定了物质基础。     

N-酰基高丝氨酸内酯降解酶的抗体制备与鉴定

根据已报道的aiiA基因及attM基因序列设计引物,分别从蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)和土壤根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中PCR扩增获得aiiA基因及attM基因,构建蛋白表达载体pET30a-aiiA及pET30a-attM,在大肠杆菌BL21中诱导表达.利用AiiA解酯酶蛋白和AttM解酯酶蛋白在SDS-PAGE中对应的产物直接成兔免疫,提取血清进行ELISA和Western Blot检测.SDS-PAGE检测发现aiiA基因及attM基因能高效表达AiiA解酯酶蛋白和AttM解酯酶蛋白.ELISA检测结果表明,抗体含量高,稀释106倍依然为有效值.Western Blot 检测结果表明抗体可特异性结合目的蛋白.应用检测结果表明抗体血清能检测到N-酰基高丝氨酸内酯降解酶相关基因的产物,在验证群体感应和群体淬灭等方面将具有应用价值.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因的克隆及植物表达载体构建

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是革兰氏阴性细菌致病过程中的关键信号分子,芽孢杆菌中广泛存在的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。利用PCR方法从苏云金芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA的同源性为89%～97%。将该基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了aiiA基因的植物表达载体pCAM-aiiA,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建

为进一步阐明农杆菌介导的遗传转化分子机制,进而利用分子生物学方法提高农杆菌转化水稻效率,以水稻品种中花11为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白进行了功能研究。通过同源性比对得到水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白序列,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因2个片段(R1和R2)的RNAi表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2,通过农杆菌介导的方法分别转化水稻中花11。对转基因抗性愈伤进行统计,结果表明,由携带pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2载体转化的抗性愈伤的形成受到一定程度抑制。经PCR检测,证明2个片段R1和R2均成功整合到再生水稻植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示部分RNAi转基因植株中OsVIP1基因表达被成功抑制。     

Web2.0,以个人为中心的互联网时代的到来

本文介绍了Web2．0的知识和背景，对Web2．0出现的基础以及典型技术和应用作了阐述，同时对其作出了前景展望。     

盐胁迫对葡萄苗期多胺和激素代谢的影响

【目的】 研究盐胁迫条件下,葡萄叶片中多胺含量、多胺氧化酶、多胺合成酶活性以及激素的动态变化,研究不同盐胁迫强度对多胺类物质及激素代谢的影响。【方法】 采用盆栽基质培养模拟盐胁迫环境,设置4个NaCl处理梯度:0 (CK)、1、2和3 g/kg。多胺和激素含量的测定采用高效液相色谱法,多胺合成及分解酶活性的测定采用紫外分光光度计比色法。【结果】 盐胁迫处理后,葡萄叶片中多胺含量和脱落酸含量较对照而言显著增加,玉米素含量显著降低,随胁迫时间的延长,Put、Spm、Spd、ABA以及PAO、DAO、ADC、ODC、SAMDC活性均呈先上升后下降趋势,在10 d及10 d后达到峰值。ZT呈逐渐下降的趋势,并随胁迫强度增大而减小;进行显著性分析后,叶片中多胺含量与Put、Spm、Spd含量呈极显著正相关,DAO、ADC、ODC活性与Put含量呈显著正相关,PAO与SAMDC活性与Spm和Spd含量也呈极显著正相关。【结论】 3种多胺经酶的合成代谢后和激素共同缓解葡萄苗所遭受到的盐胁迫,期间主要发生作用的是多胺合成酶,盐胁迫下多胺与激素含量之间的变化关系也十分密切。     

市级综合气象信息分析与管理系统的设计与实现

以抚顺地区3个国家基本站50余年气象资料为依托,采用Microsoft Excel工作表实现由气候和农业气候2部分构成的气象与农业综合信息处理系统的基本思路、方法、内容、用途和使用情况。为了实现气候分析及应用的科学化、客观化、系统化、规范化、程序化及连续化的业务目标,按业务流程设计与实现的,包括资料处理、气候趋势模拟、气候预测、气候鉴定、季节性信息化处理、农作物产量预报、气候生产潜力分析等一系列内容在内的系统建设。关键是解决了大量的计算问题,建立了区域性通用模式。     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

Yield and quality of maize stover: Variation among cultivars and effects of N fertilization

Biomass yields and concentrations of crude protein(CP), ether extract(EE), neutral detergent fiber(NDF), acid detergent fiber(ADF), and crude fiber(CF) were analyzed for five cultivars of summer-sown maize(Zea mays L.) stover grown in field trials at three rates of N fertilization, and sampled immediately after grain harvest.The results revealed differences in yields and concentrations of nutrients according to stalk height and hence harvest portion among the cultivars.N application greatly increased biomass yield and CP, especially in upper stalks and to a lesser extent, EE.Concentrations of NDF and ADF decreased as N rate increased.The results show that stovers from all local popular maize cultivars are suitable as animal fodder and that moderate N application improves feed quality of stover.     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

Multi-variable grey model (MGM (1,n,q)) based on genetic algorithm and its application in urban water consumption

Urban water consumption has some characteristics of grey because it is influenced by economy, population, standard of living and so on. The multi-variable grey model （MGM（1,n））, as the expansion and complement of GM（1,1） model, reveals the relationship between restriction and stimulation among variables, and the genetic algorithm has the whole optimal and parallel characteristics. In this paper, the parameter q of MGM（1,n） model was optimized, and a multi-variable grey model （MGM（1 ,n,q）） was built by using the genetic algorithm. The model was validated by examining the urban water consumption from 1990 to 2003 in Dalian City. The result indicated that the multi-variable grey model （MGM（1,n,q）） based on genetic algorithm was better than MGM（1,n） model, and the MGM（1,n） model was better than MGM（1,1） model.     

Molecular detection of virulence genes in Campylobacter species isolated from livestock production systems in South Africa

Campylobacter species are a major cause of foodborne bacterial infections in both developed and developing countries worldwide. Campylobacter jejuni is responsible for the majority of infections. This study was conducted to identify virulenceassociated genes in Campylobacter species isolated from livestock production systems in South Africa. A total of 250 fecal samples consisting of cattle(n=50), chickens(n=50), goats(n=50), sheep(n=50) and pigs(n=50) were randomly collected from livestock in Eastern Cape and KwaZulu-Natal provinces of South Africa between April and October 2018. The samples were analyzed for the presence of virulence genes in Campylobacter species using molecular PCR-based methods. It was found that 77 and 23% of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli respectively were isolated from all the livestock samples. There were positive significant(P0.05) correlations amongst all the virulence genes that were investigated. Chisquare and Fisher's exact tests were implemented to test for the effect of livestock species on the presence or absence of virulence genes. The study demonstrated that most of livestock species can potentially cause zoonotic infections and food poisoning due to the high prevalence of Campylobacter. The high prevalence of virulence genes highlights the significance of Campylobacter in livestock production systems in South Africa. This requires the implementation of one-health approaches to reduce the impact of foodborne and zoonotic diseases for the welfare of human and animal health.     

红苕饲粮中添加铜和/或喹乙醇对猪生产性能及某些血液生化指标的影响

选体重约38公斤的长白(♂)×成华(♀)杂交猪20头,随机分为四组,饲予四种不同的饲粮,研究饲粮中添加铜和/或喹乙醇对猪生产性能和某些血液生化指标的影响。结果表明:基础组、加铜组、加喹乙醇组和两者同时加组全期日增重分别为674、761、796、678克,日采食量分别为2.50、2.65、2.74、2.40公斤,饲料利用率分别为3.73、3.49,3.44、3.54,添加铜和/或喹乙醇对试验第65天血清铜兰蛋白、尿素氨及屠宰率、背膘厚和眼肌面积无显著影响(p>0.05);添加铜使65天血清碱性碱酸酶活性极显著增高(p<0.01),添加喹乙醇有使之升高的趋势,两者同时添加时,碱性酸磷酶活性降低。