腺病毒及腺病毒载体的研究进展

对腺病毒的结构、转录和复制特性进行了较全面的介绍,回顾了腺病毒载体的发展历程,同时对各种动物腺病毒的现状进行了描述。进一步分析了腺病毒载体易于构建和操作、宿主范围广、感染性强等特性的分子机制。因其具有广泛的组织亲和性,腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者。随着动物腺病毒载体的发展,它将在控制人和动物传染性疾病,特别是病毒性传染病以及人类的基因治疗中发挥越来越重要的作用。     

腺病毒在动物口蹄疫防治中的研究进展

由于腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合到动物宿主细胞染色体等优点,已被认为是最有效的转基因载体之一,成为重组疫苗和基因治疗研究的热点。本文就腺病毒载体的生物学特性、研究进展及在口蹄疫防治中发挥的重要作用进行综述。     

腺病毒载体研究进展与展望

腺病毒载体具有高效传递和表达基因的能力(尤其是在体外),在过去的15年里已经得到充分地证实。腺病毒载体由于宿主范围广泛和对人体的低致病性、病毒颗粒比较稳定、基因组较少发生重排等优点,已经成为最常用的病毒载体之一。但由于细胞的靶向性和宿主的免疫反应限制了腺病毒载体的应用和发展,为此,对腺病毒载体进行了不断改进和完善,其潜在的应用价值也得到了广泛关注。现就对腺病毒载体的特点,改进和应用方面的研究进展综述如下。     

腺病毒载体在基因治疗研究中的应用

近年来腺病毒载体以操作方便、滴度高、安全性好等优点,已经成为基因治疗研究的热点。介绍了腺病毒的结构特点,利用重组腺病毒载体进行基因治疗的原理,腺病毒载体在基因治疗中的应用等。并对腺病毒载体的发展趋势和存在问题进行了阐述。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。     

狂犬病毒CVS株G基因和N基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过引入内部核糖体进入位点序列,构建狂犬病毒G基因和N基因共表达的腺病毒载体。通过RT-PCR方法扩增得到RVG基因、N基因。N基因先亚克隆入pIRES质粒;G基因经Kpn I和Mlu I,pIRES-N质粒经Mlu I、Not I双酶切,回收目的基因后与经Kpn I和Not I双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒,RT-PCR 法检测狂犬病毒糖蛋白和核蛋白基因片段。该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR 法可检测到糖蛋白和核蛋白基因片段。试验成功构建了G和N双基因共表达重组腺病毒载体,为狂犬病活载体疫苗的研制提供了依据。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF1、ORF2基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果

【目的】构建含PCV2ORF1和ORF2基因的串联重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价。【方法】扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在细菌BJ5183内完成重组,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶线性化后转染293细胞,包装成重组腺病毒,然后从致细胞病变、荧光检测及PCR检测等方面对该重组腺病毒进行了鉴定。以该重组腺病毒免疫小鼠,对免疫鼠血清中PCV2的特异性抗体进行检测。【结果】得到了PCV2的ORF1和ORF2基因,pMD18-ORF1-ORF2和pAdCMV-ORF1-ORF2载体构建成功,获得了含有PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒。该重组腺病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中可检测到PCV2的特异性抗体。【结论】成功构建了含PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒,此腺病毒可诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.