腺病毒及腺病毒载体的研究进展

对腺病毒的结构、转录和复制特性进行了较全面的介绍,回顾了腺病毒载体的发展历程,同时对各种动物腺病毒的现状进行了描述。进一步分析了腺病毒载体易于构建和操作、宿主范围广、感染性强等特性的分子机制。因其具有广泛的组织亲和性,腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者。随着动物腺病毒载体的发展,它将在控制人和动物传染性疾病,特别是病毒性传染病以及人类的基因治疗中发挥越来越重要的作用。     

腺病毒载体在基因治疗研究中的应用

近年来腺病毒载体以操作方便、滴度高、安全性好等优点,已经成为基因治疗研究的热点。介绍了腺病毒的结构特点,利用重组腺病毒载体进行基因治疗的原理,腺病毒载体在基因治疗中的应用等。并对腺病毒载体的发展趋势和存在问题进行了阐述。     

腺病毒在动物口蹄疫防治中的研究进展

由于腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合到动物宿主细胞染色体等优点,已被认为是最有效的转基因载体之一,成为重组疫苗和基因治疗研究的热点。本文就腺病毒载体的生物学特性、研究进展及在口蹄疫防治中发挥的重要作用进行综述。     

腺病毒载体的研究进展

叙述了腺病毒的生物特性、腺病毒载体的发展进程和构建策略、在动物疫苗研究中的应用及其优势,同时阐述了腺病毒载体遇到的免疫学问题,并对腺病毒载体进行了展望,随着动物腺病毒载体的发展,它必将在控制人和动物传染病,特别是在病毒性传染病中发挥越来越重要的作用。     

牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区（coding sequence,CDS）序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并在293A细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒,GFP标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞,实时荧光定量法（qRT-PCR）检测干扰效率。【结果】筛选出靶向牛SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了pAd-1053和阴性对照pAd-NC重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053和Ad-NC高滴度病毒,测定得到的病毒滴度分别为7×108 GFU•mL-1和9×108 GFU•mL-1。Ad-1053和Ad-NC分别侵染牛前体脂肪细胞,qRT-PCR检测结果显示Ad-1053可显著降低SREBP1基因的mRNA 水平（干扰率＞85%）,而Ad-NC对SREBP1基因表达无明显影响。【结论】成功筛选得到靶向干扰牛SREBP1基因的有效shRNA,并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。     

重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定

[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。     

心肌特异性α-actin启动子重组腺病毒的构建及其鉴定

为了探讨心肌肌动蛋白(α-actin)基因启动子的心肌组织特异性及其表达活性,构建了心肌组织靶向性表达的基因载体,应用PCR从pEGFP-N1-α-actin-P质粒中克隆出α-actin启动子片段,将其插入到切除CMV启动子的腺病毒穿梭载体pAdTrack中,构建出pAdTrack-actin重组穿梭载体,经酶切和测序鉴定正确后用PmeI线性化,与含有腺病毒骨架DNA的pAdEasy-1质粒在BJ5183大肠杆菌细胞中同源重组成新的重组体pAd-easy-actin,抽提重组体DNA,经PacI酶切回收后以脂质体法转染人胚肾细胞株HEK293,包装出完整腺病毒pAd-actin进行PCR检测,并应用蚀斑形成试验测定病毒滴度。结果显示,重组腺病毒中含有α-actin启动子片段,病毒滴度为7×107pfu/mL。表明含心肌α-actin启动子的重组腺病毒pAd-actin构建成功。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

水貂生长激素基因重组腺病毒的构建

本研究利用AdEasyTMXL腺病毒载体系统构建了水貂生长激素基因重组腺病毒。利用PCR、酶切、凝胶回收等方法,从质粒pCMVmGH中获得水貂生长激素基因(mGH),构建穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH。pShuttle-CMV-mGH经PmeⅠ酶切线性化后转化至BJ5183感受态大肠杆菌内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH。重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞。PacⅠ酶切结果表明质粒重组成功。转染第10天,细胞出现圆缩、死亡、漂浮等典型病变,透射电镜检测到重组病毒。TCID50测得第2代重组病毒的滴度达到10-7.89/0.1ml。RT-PCR结果证实,重组病毒能够正确转录目的基因。结果表明本试验成功构建了水貂生长激素基因重组腺病毒,为水貂促生长的研究提供了新的科学手段。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定

[目的]构建表达鹅细小病毒 （GPV） VP3基因的重组腺病毒,为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础.[方法]以重组质粒pcDNA-VP3为模板,以GPV-VP3为目的基因,构建GPV-VP3重组腺病毒载体,通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒,通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况.[结果]扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp,线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因,表达蛋白的分子量约为60Ku.[结论]该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础.     

表达狂犬病毒糖蛋白和核蛋白的重组腺病毒的生物学特性及免疫研究

对狂犬病毒G+N双基因复制缺陷型腺病毒穿梭载体进行转染,以获得融合表过狂犬病毒糖蛋白和核蛋白重组腺病毒,并对其进行生物学特性和免疫学研究.结果表明:将含有狂犬病毒G+N的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/G+N与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌细胞内同源重组,可获得带有目的基因的重组腺病毒载体pAd/G+N,经PacI酶切后转染HEK-293细胞,可获得带有目的基因的重组腺病毒.重组腺病毒在HEK-293细胞中连续传代15代次后,在细胞内的病变时间缩短为20 h以内.经测定,重组腺病毒对HEK-293细胞的TCID50为10-8.0.mL-1,用RT-PCR法可检测到狂犬病毒糖蛋白和核蛋白基因片段;重组腺病毒经口服免疫小白鼠,对狂犬病毒CVS毒株的免疫保护率可达80%.     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

表达猪白介素2基因重组腺病毒的构建及其免疫增强作用

以猪白介素2基因(pIL-2)为研究对象构建表达pIL-2的重组腺病毒,并研究其作为细胞因子佐剂的免疫增强作用。用RT-PCR的方法扩增pIL-2基因,将pIL-2基因克隆到腺病毒穿梭载体AdTrack中,构建出重组腺病毒穿梭质粒AdTrack-pIL-2,然后在大肠杆菌BJ5183内和骨架载体AdEasy同源重组,获得重组腺病毒骨架载体AdEasy-pIL-2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-pIL-2,并通过兔体交互试验来检测Ad-pIL-2的免疫增强作用。经PCR、RT-PCR和Western blot检测,成功构建了Ad-pIL-2,病毒滴度可以达到108.25pfu/mL,并通过兔体交互免疫试验证明Ad-pIL-2可以提高兔的抗体水平。用腺病毒构建的Ad-pIL-2在兔体上具有免疫增强作用,为下一步的猪体试验研究和细胞因子佐剂的开发奠定基础。