猕猴桃实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选在猕猴桃中稳定表达的内参基因,以确保其基因表达分析结果的可靠性。应用实时荧光定量PCR技术分析了ACTB,TUB,18S rRNA和GAPDH四个常用植物内参基因在华特猕猴桃不同组织及果实不同发育时期的mRNA表达情况。经Ge Norm软件分析发现,4种内参基因的表达稳定性各异,TUB和ACTB在6种不同组织中表达均稳定,TUB和ACTB组合适合作华特猕猴桃不同组织基因表达的内参基因;18S rRNA在果实不同发育时期的表达最稳定,18S rRNA和TUB组合最适合作为分析华特猕猴桃果实不同发育时期基因表达的内参基因。     

产蛋前期和产蛋期籽鹅组织内参基因的稳定性

【目的】分析比较使用广泛的7个候选内参基因在产蛋前期和产蛋期籽鹅组织中的表达情况,筛选籽鹅组织基因表达分析中最佳的内参基因及其数目。【方法】应用实时定量反转录PCR技术,分别检测28S rRNA、18S rRNA、GAPDH、ACTB、HPRT1、SDH和TUB在产蛋前期与产蛋期健康籽鹅肝脏、肾脏、心脏、腿肌和卵巢组织中的表达情况,采用绝对定量方法确定基因拷贝数,然后分别使用geNorm和NormFinder程序进行数据分析。【结果】产蛋前期籽鹅各组织中7个内参基因表达稳定度的顺序分别为：GAPDH=HRPT1（0.195）＞TUB（0.244）＞28S rRNA（0.414）＞18S rRNA（0.495）＞ACTB（0.541）＞SDH（0.610）;产蛋期籽鹅各组织中7个内参基因表达稳定度的顺序分别为：GAPDH=28S rRNA（0.128）＞TUB（0.181）＞ACTB（0.192）＞SDH（0.221）＞HRPT1（0.316）＞18S rRNA（0.362）,且7个基因的配对差异分析分别为V2/3（产蛋前期）=0.084、V2/3（产蛋期）=0.069,内参基因的最适数目均为2个。【结论】产蛋前期和产蛋期籽鹅组织目的基因的表达分析中相对适合的内参基因分别为GAPDH和HRPT1、GAPDH和28S rRNA。     

幼龄小鼠小肠组织内参基因的选择

选择B2 M、ACTB、GAPDH、SDHA、HPRT1和ARBP共6个内参基因,研究其在幼龄小鼠小肠组织内的表达情况.结果表明:6个内参基因均可获得特异性扩增产物;经geNorm程序和NormFinder分析,6个内参基因稳定度由高到低为SDHA=HRPT1>ARBP>ACTB>GAPDH>B2 M;基因表达的稳定值分别为0.006(SDHA)、0.006(HRPT1)、0.007(ARBP)、0.018(ACTB)、0.029(GAPDH)、0.111(B2 M),最终筛选出SDHA和HRPT1 2个内参基因适合用于校正目的基因的表达.     

朱砂叶螨各发育阶段内参基因评估及筛选

在实时荧光定量PCR试验中需引入一个或几个表达稳定的内参基因作为参照物对表达结果进行校正和标准化处理,但并非所有内参基因都完美地适用于任何特定试验条件下的生物样本,要得到准确、真实的定量结果,就需要筛选与试验匹配的最佳内参基因。研究通过实时荧光定量技术,利用geNorm软件分析,对朱砂叶螨敏感品系及抗炔螨特品系各个发育阶段中6个常用内参基因的表达稳定性进行评估。结果表明,两个品系间RPS18与α-TUB内参基因组合表达稳定度较高;不同发育阶段α-TUB与GAPDH内参基因组合表达稳定度较高。     

花绒寄甲荧光定量PCR分析中内参基因的选择

合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件。以存活时间为6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的花绒寄甲成虫为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了核糖体蛋白11(RPS),丁二酸脱氢酶复合物(SDHA)、组蛋白(Histone)、泛素结合蛋白(UBC)、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅰ(PGK)、延伸因子(EF-1α)、β-肌动蛋白(β-Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白RPL13(L13)、α-微管蛋白(α-Tubulin)共10个看家基因mRNA的表达情况。经过geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个统计学程序,综合分析确定RPS基因或α-Tubulin基因在不同存活时间的花绒寄甲中为较佳用于校正目标基因的内参选择,而RPS、GAPDH和α-Tubulin的组合为最佳校正目标基因内参基因组合。     

尖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选能够稳定表达的内参基因用于尖裸鲤Oxygymnocypris stewarti实时荧光定量PCR分析,以尖裸鲤血液、心脏、肝、脾、鳃、头肾、中肾、后肾、前肠、中肠、后肠、性腺、眼、垂体、脑、红肌、白肌和皮肤18个组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术比较了GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、HPRT1(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1)、RPL13(核糖体蛋白L13)、RPL19(核糖体蛋白L19)、RPL13a(核糖体蛋白L13a)、SDHA(琥珀酸脱氢酶亚基A)和ACTB(β-肌动蛋白)7个候选内参基因的表达情况,并采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行分析。结果表明:GeNorm分析显示,7个候选内参基因的平均表达稳定值(M)依次为RPL13=RPL13aRPL19GAPDHACTBSDHAHPRT1,其中RPL13和RPL13a的M值均最小(0.62);NormFinder分析显示,7个候选内参基因的M值依次为RPL13RPL13aRPL19GAPDHACTBSDHAHPRT1,其中RPL13的M值最小(0.30);BestKeeper分析显示,7个候选内参基因的标准差(S.D.)依次为RPL13RPL19GAPDHHPRT1RPL13aSDHAACTB,变异系数(CV)值依次为RPL13RPL19HPRT1GAPDHSDHARPL13aACTB,其中RPL13的标准差(0.84)和变异系数(4.54%)均最小;7个候选内参基因在尖裸鲤不同组织中的表达量存在差异。研究表明,7个内参基因中RPL13的表达较为稳定,可作为尖裸鲤实时荧光定量PCR分析的适宜内参基因,本研究结果可为尖裸鲤遗传学及分子生物学等研究提供基础数据。     

镰刀菌酸胁迫下节瓜实时荧光定量 PCR分析内参基因的选择

针对不同试验材料及条件选择合适的内参基因是正确利用实时荧光定量PCR 分析目的基因表达模式 的前提条件。以4 个常用看家基因（GAPDH尧Actin尧UBQ尧CYP）和2个新内参基因（CACS尧F-box）作为候选内参基因、 运用实时荧光定量PCR 技术、分析它们在节瓜不同组织（根尧茎尧叶）及镰刀菌酸（fusaric acid, FA）胁迫下的表达稳定 性。经RefFinder 在线软件综合分析、结果表明、节瓜经枯萎病毒素FA 胁迫后Actin 和F-box 表达稳定;而在节瓜不 同组织中F-box 基因表达稳定性最高;另外、传统常用看家基因GAPDH 和CYP因在不同试验条件下总体表达水平 都比较差而不适合作为相应条件下的内参基因。研究结果为节瓜抗枯萎病相关基因的表达分析奠定了基础。     

二倍体和四倍体泥鳅qRT-PCR分析中内参基因优选

为筛选在泥鳅中稳定表达的内参基因,以确保泥鳅基因表达分析结果的可靠性,选取ACTB、TUBA、EF1A、GAPDH、TUBB和18SrRNA 6个常用的内参基因作为候选内参基因,分别用BestKeeper、geNorm、NormFinder、ΔCt和RefFinfer软件分析这6个基因在二倍体和四倍体泥鳅胚胎发育阶段、成鱼组织间以及倍性间表达的稳定性。结果显示,在胚胎发育各阶段,TUBB和TUBA的表达最稳定,可作为胚胎发育阶段qRT-PCR分析的内参基因;其中,TUBB在泥鳅倍性间的表达差异不显著,因此,可作为泥鳅胚胎发育中跨倍性qRT-PCR研究的内参基因。在成鱼各组织中,ACTB和18SrRNA的表达最稳定,可用作组织间qRTPCR分析的内参基因;其中,18SrRNA在倍性间的组织表达差异不显著,因此,可作为泥鳅组织间跨倍性qRTPCR的内参基因。     

金魁猕猴桃RT-qPCR内参基因的筛选

以'金魁'猕猴桃(Actinidia deliciosa)根、茎、叶、花瓣、花萼、雌蕊、子房、幼果为材料,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析了ACT、CYP2、RP2、GAPDH、TUB和TUA 6个常用内参基因在猕猴桃不同器官组织中的表达情况,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的稳定性进行了评价。结果表明:ACT和TUA基因在各组织中的表达量差异较小,表达相对稳定;在利用RT-qPCR分析比较猕猴桃不同器官组织中的基因表达差异时,可选择ACT作为内参基因。     

仔猪外周血中内参基因的筛选及细胞因子和受体的表达水平

【目的】中国地方猪种在抗病性和免疫力方面优于国外猪种,但是对中外猪种抗病力差异的遗传基础和免疫机理却了解甚少。有推测不同品种猪对疾病的抵抗力不同可能在细胞因子和受体的表达水平上有所反映。本研究以抗病力强的大蒲莲和抗病力相对较弱的长白猪的断奶仔猪为研究对象,对6个具有重要功能的细胞因子（促炎症细胞因子（IL8和TNFα）,抗炎症细胞因子（IL10）,干扰素调节因子（IRF3）和干扰素（IFNA 和IFNG））和1个最具代表性的模式识别受体（TLR4）基因在大蒲莲和长白仔猪群体外周血液中的基因表达量进行检测,并对各基因进行品种和母猪效应分析,为了解中外不同猪种的免疫水平奠定基础。【方法】采集大蒲莲（104头）和长白（171头）35日龄仔猪的外周血,提取总RNA,逆转录为cDNA后,利用荧光定量PCR法,首先对6个常用的候选内参基因（ACTB、GAPDH、B2M、TBP、RPL4和PPIA）利用geNorm 软件进行稳定性评价分析,筛选仔猪外周血RNA基因定量分析中稳定表达的内参基因,然后利用该内参基因进行校正,对上述细胞因子和模式识别受体基因在大蒲莲和长白仔猪群体外周血中的表达量进行定量,并利用最小二乘法对细胞因子和受体在大蒲莲和长白仔猪群体中的表达量进行品种和母猪效应分析。【结果】研究结果归纳为4个方面： 1.外周血样品中内参基因稳定性值M 从大到小依次为：ACTB（0.595）＞GAPDH（0.571）＞PPIA（0.469）＞RPL4（0.466）＞TBP（0.461）＞B2M（0.440）,选择表达稳定性最高的基因B2M作为内参基因对细胞因子和受体基因的表达量进行校正。2.检测的6个细胞因子的基因表达量存在很大的差异,各细胞因子基因表达量ΔCt最大值和最小值之间差值分别为9.23-14.25和5.83-8.73;受体TLR4的ΔCt值的最大和最小值之间相差相对较小,大蒲莲和长白仔猪分别为5.03和3.82。3.大蒲莲和长白两品种间相比较,细胞因子在长白猪群体中的表达量平均值均高于大蒲莲群体,而受体TLR4的基因表达量在长白猪群体中的表达量低于大蒲莲群体;而且,大蒲莲群体内个体间细胞因子和受体表达量变异系数（平均31.43%）要大于长白群体（平均19.10%）,这与大蒲莲选育程度低,群体内个体间的差异程度要大相一致。4. 品种效应分析表明除IL10外,其他6个目的基因的ΔCt值品种间差异达显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）水平。母猪效应分析表明母猪对各细胞因子和受体的影响均达到了极显著水平（P＜0.01）。【结论】成功筛选了外周血基因表达分析中稳定表达的内参基因（B2M）,对常规饲养管理下大蒲莲和长白仔猪外周血中的主要细胞因子和受体基因的表达进行群体水平分析。本研究结果为了解中外不同猪种的种质特性和抗病品种的选育提供了基础数据。     

巴夫杜氏藻GAPDH基因部分序列的克隆

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的一个关键酶,由于其基因表达量相对恒定.因此在定量和半定量PCR试验中常被用作内源参照基因来确定目标基因的相对表达量.从巴夫杜氏藻(Dunaliella pmva)中克隆GA PDH基因,并对基因序列进行了分析.以巴夫杜氏藻cDNA为模板,根据GAPDH的保守序列设计引物...     

RNA干扰用siRNA的体外转录合成

RNA干扰(RNA interference，RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法，正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具，而获得符合干扰要求的短双链干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是进行RNA；研究的首要步骤。本研究建立了体外转录合成siRNA方法。并用其生成的siRNA干扰鸡成纤维细胞外源绿荧光蛋白(GFP)基因和内源3—磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达。结果显示，siRNA能特异性降低鸡成纤维细胞中内外源基因的表达。本实验认为这种以DNA为模板体外转录合成siRNA方法操作简单、成本低、产物得率高，值得从事RNA研究者参考借鉴。     

siRNA对鸡胚成纤维细胞中GAPDH基因表达的抑制作用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过短双链RNA(small interference RNA,siRNA)介导的特异性抑制相应基因表达的新技术。作为研究基因功能的有效手段,该技术已在线虫、果蝇、斑马鱼和鼠等动物中进行了应用。本研究利用体外转录合成的短双链干扰RNA(siRNA),针对鸡的管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),在鸡胚成纤维细胞中对其表达进行干扰。结果显示siGAPDH能有效阻断GAPDH基因在鸡胚成纤维细胞中的表达,而不相关的siRNA则对该基因的表达没有影响,证明在鸡细胞中也存在RNA干扰现象,为利用RNAi技术对鸡的基因功能研究奠定了一定基础。     

鸭梨GAPDH基因家族的克隆及其表达特征

【目的】从鸭梨中克隆GAPDH基因家族,筛选合适的鸭梨内参基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆鸭梨GAPDH基因家族,用半定量PCR方法分析4个鸭梨GAPDH基因在鸭梨幼叶、花蕾、盛花期花瓣、幼果期果肉和成熟期果心,以及幼果期、膨大期、成熟期和褐变期果心的表达特征。【结果】从鸭梨中成功克隆出了4个GAPDH基因,分别命名为PbGAPDHa、PbGAPDHb、PbGAPDHc1和PbGAPDHc2。其中PbGAPDHa和PbGAPDHb是由一个共同的祖先基因倍增进化来的,主要在鸭梨的幼叶中表达,其蛋白定位在质体;而PbGAPDHc1和PbGAPDHc2是一个基因的2种拷贝形式,在鸭梨的花、幼叶、果实等组织中表达量基本一致,在不同发育时期的果心中表达量也相近,其蛋白定位在细胞质。【结论】PbGAPDHc1和PbGAPDHc2适合作为鸭梨的内参基因。     

中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

【目的】建立GAPDH内参基因实时荧光定量PCR方法,为进一步研究中国美利奴羊(新疆型)相关基因的定量表达奠定基础。【方法】采用中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织为试材,根据Genebank中绵羊GAPDH基因序列,设计并合成一对引物,建立基于SYBR Green I染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其熔解曲线分析。【结果】以cDNA为模板建立的标准曲线循环阈值(Ct)与标准cDNA模板在一定浓度范围内呈良好的线性关系,GAPDH基因标准曲线中模板拷贝数(X)与Ct值的关系为Ct=一3.679 51g/X+35.648,相关系数R=0.999 8;试验重复性好,批内和批间变异系数(CV%)分别为0.22%～3.45%和1.30%～4.89%。【结论】所建立的方法具有快速、线性范围广、重复性强等特点,GAPDH可作为内参基因用于绵羊相关基因的定量表达研究。     

猪链球菌2型毒力因子gapdh基因的克隆·表达及与Hela细胞互作蛋白的筛选

[目的]克隆并在大肠杆菌中表达猪链球菌2型毒力因子gapdh基因,寻找与GAPDH互作的受体蛋白.[方法]扩增猪链球菌2型甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapdh基因并构建表达质粒pET28a-gapdh.[结果]在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功表达了约41 kDa的融合蛋白GAPDH.Western blot试验说明GAPDH具有良好的免疫学活性.利用新西兰大白兔制备抗GAPDH蛋白的多克隆抗体.运用配体重叠技术,在HeLa细胞中初步找到了一个与GAPDH蛋白作用的潜在受体蛋白.[结论]为进一步研究猪链球菌2型的分子致病机理奠定基础.