广西某规模化猪场胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离鉴定

为调查广西地区某规模化猪场疑似患猪传染性胸膜肺炎猪的病原、血清型及有效治疗药物等情况,首先对患病猪进行剖检观察其病理变化,同时无菌采集病猪肺脏等病料,接种平板后纯化培养,然后通过革兰染色镜检、生化鉴定、16S rRNA序列比对、血清型及毒素基因分析等方法进行鉴定,并对分离菌株的耐药性和动物致病性进行探究。结果：从病料中分离到1株细菌,其菌落、菌体形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列符合胸膜肺炎放线杆菌(APP)特征,该菌株含有ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅣ三种毒素,属于APP血清5型,因此将其命名为APP5-YXLM;药敏试验结果显示,该菌对β-内酰胺类药物和头孢类药物敏感,对红霉素、庆大霉素、多西环素、四环素等6种药物耐药;动物致病性试验表明,该菌株对小鼠具有较强的致病性,其半数致死量(LD₅₀)为7.06×10~8 CFU。试验结果为该发病猪场猪传染性胸膜肺炎的防治提供了理论依据,同时也为掌握胸膜肺炎放线杆菌在广西地区的流行情况提供了数据支持。     

猪传染性胸膜肺炎的防控进展

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的猪的一种严重的呼吸道传染病,导致养猪业严重的经济损失,该病在世界各地广泛分布,在我国的流行日益严重。该病主要经呼吸道传播发病,猪和带菌猪是主要传染源;病猪临床表现以呼吸道症状为主,分为急性型、亚急性型和慢性型3种;急性和亚急性病例以纤维素性出血性胸膜肺炎为特点,慢性病例以纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征和隐性感染。随着养猪业的规模化发展,该病造成的危害日益严重,因此如何有效防控该病的发生,以此减少经济损失非常重要。本文就近年来猪传染性胸膜肺炎的防控进展进行综述,为提高猪传染性胸膜肺炎的防控效果、减少经济损失提供理论参考。     

猪链球菌2型srtA基因缺失菌株的构建及生物学特性

扩增了srtA基因的上、下游同源臂P1和P2及其全长序列,利用温度敏感型"自杀性"质粒pSET4s构建了重组质粒pSET4s-P1-P2,并将该质粒电转化入野生菌株SS2(SC21)中,通过抗生素和温度双重筛选,得到srtA基因缺失菌株,命名SC211.同时,将srtA基因定向插入穿梭质粒pAT18,构建穿梭质粒pAT18-srtA,并将该质粒电转入srtA基因缺失菌株SC211中,通过抗生素筛选,得到质粒介导的srtA基因互补菌株SC212.通过PCR、South-ern blotting等对缺失突变菌株和互补菌株进行了鉴定.对基因缺失突变菌株和回复菌株传代培养遗传稳定性试验结果显示,缺失突变菌株和互补菌株能够稳定遗传.比较了基因缺失突变菌株、互补菌株及野生菌株的生长特性、溶血活性、细胞粘附特性,结果表明,3个菌株的生长速度、溶血活性没有明显差异.基因缺失后SS2对Hep2细胞的粘附能力明显下降,只有野毒菌株的49%,互补菌株粘附能力几乎达到野毒菌株的水平,是野毒菌株的89%.CD1小鼠毒力试验结果显示,srtA基因缺失株SC211的LD_(50)(4.93×10~7)约为野毒菌株SC21的LD_(50)(8.21×10~6)的6倍,质粒介导的互补菌株SC212的LD_(50)(1.43×10~7)是野生菌株SC21的1.7倍,接近野毒菌株的水平,说明srtA基因缺失后SS2毒力显著下降.     

利用酵母双杂交系统筛选与猪2型链球菌透明质酸酶(HYL)相互作用的蛋白质

以猪链球菌2型(SS2)透明质酸酶(HYL)作为诱饵蛋白,利用CytoTrap酵母双杂交系统,从人的肺组织cD-NA文库中筛选与HYL相互作用的蛋白,探索HYL在SS2致病中的作用.首先,通过PCR扩增SS2 Hyl全长基因,定向克隆到pSos载体多克隆位点中,构建诱饵载体(pSos-Hyl).同时,将Hyl克隆到pET-28c载体中,构建重组表达栽体(pET28c-Hyl).将pSos-Hyl和人肺cDNA文库(pMyr-cDNA)共转化cdc25H酵母细胞,筛选与HYL相互作用的阳性克隆.经过筛选和重复验证,并时所得到的栽体插入片段进行测序,经BLAST分析,从人肺组织cDNA文库中得到2个与HYL相互作用的阳性克隆,2个基因分别与γ内收蛋白(Homo sapiens adducin 3(gam-ma)(NT-030059.12),ADD3)和装配架离子转运蛋白(Homo sapiens chromosome 6 genomic contig,reference as-sembly ion transporter protein(NT_034880.3),AITP)基因的同源性为99%和100%.将HYL原核表达,ADD3和AITP真核细胞表达后,用免疫共沉淀试验分别验证了HYL与ADD3和AITP之间的相互作用,为进一步研究ADD3和AITP可能与SS2致病的关系奠定了前期基础.     

猪链球菌2型毒力因子gapdh基因的克隆·表达及与Hela细胞互作蛋白的筛选

[目的]克隆并在大肠杆菌中表达猪链球菌2型毒力因子gapdh基因,寻找与GAPDH互作的受体蛋白.[方法]扩增猪链球菌2型甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapdh基因并构建表达质粒pET28a-gapdh.[结果]在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功表达了约41 kDa的融合蛋白GAPDH.Western blot试验说明GAPDH具有良好的免疫学活性.利用新西兰大白兔制备抗GAPDH蛋白的多克隆抗体.运用配体重叠技术,在HeLa细胞中初步找到了一个与GAPDH蛋白作用的潜在受体蛋白.[结论]为进一步研究猪链球菌2型的分子致病机理奠定基础.     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌S4074菌株毒素Ⅰ的序列,设计了1对引物,从本室自己分离的菌株中扩增了猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ的结构基因(aoxICA),扩增的DNA片段大小为3 640 bp(4 687～8 326 bp),将其克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定和序列测定后,进一步将其插入pET-28a中构建了原核表达载体,SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了表达,而且表达的蛋白质具有免疫学活性.利用表达的蛋白作为抗原包被酶标板,建立了检测毒素Ⅰ血清抗体的ELISA方法.临床应用表明,该方法可用于APP强毒株感染的检测.     

胸膜肺炎放线杆菌毒素分子致病机理研究进展

胸膜肺炎放线杆菌是引起猪传染性胸膜肺炎的一种重要病原菌。该病具高度传染性，给养猪业造成巨大的经济损失,本文就病原、毒素成分，毒素分子结构，分子致病机理的研究作了综述。     

胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxIV基因缺失突变株的构建和鉴定

ApxIV是胸膜肺炎放线杆菌的一种RTX毒素,为探究其在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中的作用,以血清7型APP HB04为亲本菌株,通过接合转移和负向筛选方法,构建了一株apxIV基因缺失突变株。通过PCR、序列分析、Southern blot分析及遗传稳定性分析等证明成功构建了突变株。对突变株生物学特性进行初步研究,发现突变株与亲本菌株相比,体外生长速度未发生明显变化,对小鼠的致病力有所降低。结果表明,毒素ApxⅣ在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中发挥一定作用。突变株的成功构建及生物学特性研究为进一步阐明胸膜肺炎放线杆菌的致病性及开发更为安全、高效的基因工程疫苗奠定了坚实基础。