微小牛蜱Bm86基因的克隆与原核表达

根据已发表的Bm86基因序列,设计表达型引物,利用RT-PCR技术,从微小牛蜱饥饿幼蜱的研磨物中扩增Bm86基因,将PCR产物连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86.测序分析表明:克隆的微小牛蜱Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97%和95.6%.然后对重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86进行双酶切,获得带有粘性末端的Bm86基因片段,并将此片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Bm86,将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测表明表达产物为分子量为88 Ku的融合蛋白,目的蛋白约占蛋白总量的39%,表达量约为1.08 mg/mL.Western blot分析表明此表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别.     

微小牛蜱Bm91基因的克隆及其真核表达载体的构建

参照GenBank中收录的微小牛蜱Bm91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,从我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱肠道和唾液腺研磨物中提取总RNA,利用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA,并采用PCR技术扩增获得的Bm91基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并进行PCR、酶切和测序分析鉴定.结果表明:所克隆的Bm91基因序列与GenBank上收录的Bm91基因序列的同源性达97.1%,而且该片段含有完整的开放阅读框;将该基因从克隆载体上用EcoRⅠ单酶切消化并亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pP1C9K的EcoRⅠ酶切位点,再次进行PCR、酶切和测序分析鉴定,结果表明成功构建并获得了微小牛蜱Bm91基因的重组真核表达载体pP1C9K-Bm91.     

新疆南疆地区微小牛蜱Bm86基因克隆及鉴定

为了克隆及鉴定新疆南疆地区微小牛蜱Bm86基因,参照Gen Bank登录的微小牛蜱Bm86基因序列,设计了可以扩增Bm86基因完整阅读框架的引物,对微小牛蜱进行总RNA提取、RT-PCR、克隆、测序、序列分析。结果表明,获得的Bm86基因长1 953 bp,与Gen Bank中登录号为M29321、HQ014398的微小牛蜱Bm86基因核苷酸同源性分别为99%、97%,且为一个完整的开放阅读框架。本研究获得的微小牛蜱Bm86基因,为获得基因工程疫苗的候选抗原及中国抗微小牛蜱疫苗制备奠定了基础。     

新疆南疆微小牛蜱Bm91基因的克隆及鉴定

试验参照GenBank登录的微小牛蜱Bm91基因序列,设计了可以扩增Bm91基因完整阅读框的引物,对新疆南疆微小牛蜱进行总RNA提取、RT-PCR、克隆、测序和序列分析。结果表明:获得的Bm91基因长1 833 bp,与GenBank中登录号为U62809和HM622263的微小牛蜱Bm91基因核苷酸同源性为98%和97%,且为一个完整的开放阅读框。新疆南疆微小牛蜱Bm91基因的正确获得,为基因工程疫苗候选抗原的获得和中国抗微小牛蜱疫苗的制备奠定基础。     

表皮葡萄球菌8-32-B 株aap基因domain B的原核表达

为获得表皮葡萄球菌aap基因domain B片段的原核表达产物,采用PCR方法扩增引起新疆南疆地区奶牛乳房炎的表皮葡萄球菌株aap基因domain B片段,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a(+)-aap,将重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21中诱导表达。结果表明,克隆得到aap基因domain B片段为2 316bp,Aap蛋白分子质量184.5ku。在宿主菌E.coli BL21中表达的最佳诱导时间为4h,IPTG最佳诱导浓度为0.75mmol/L;纯化时洗杂缓冲液中咪唑浓度为40mmol/L,洗脱缓冲液中咪唑浓度为200mmol/L时可以获得单一Aap蛋白。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达和免疫原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。     

蜱传脑炎病毒E基因的重组质粒构建及其在原核细胞的表达

通过表达蜱传脑炎病毒E蛋白,为制备蜱传脑炎快速检测试纸条的奠定基础。根据GenBank数据库中已发表的蜱传脑炎病毒的基因序列,检索并合成蜱传脑炎病毒目的基因E,设计引物,PCR扩增,克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,在BL21细菌内表达蜱传脑炎病毒E蛋白。结果表明:经过PCR试验和双酶切试验鉴定,克隆测序正确,通过重组质粒,成功地表达出蜱传脑炎病毒E蛋白。     

HLA-A胞外区成熟肽基因的克隆及其原核表达载体的构建

根据GenBank基因库中HLA-A胞外区成熟肽基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从健康人血液中扩增HLA-A胞外区基因,扩增产物进行T-A克隆、测序.结果表明,获得的HLA-A胞外区基因大小为819 bp,与模板序列的同源性为96%.利用基因重组技术,将HLA-A胞外区基因亚克隆入pET-21a(+) 载体中.经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET-21/ HLA-A中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET-21/ HLA-A.     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

利用Red重组系统敲除APEC毒力岛irp2基因

应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,以质粒pKD3为模板,设计irp2基因序列敲除引物,引物5'端有51 bp的拟敲除基因的同源臂,3 '端为扩增引物,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因,通过第1次同源重组将拟敲除的irp2基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶质粒pCP20在FRT位点发生第2次同源重组,消除抗性基因.结果表明,利用该重组系统成功敲除了禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因.为深入研究irp2基因在禽致病性大肠杆菌致病过程中所发挥的作用打下基础.     

牛源耐药性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及黏附因子基因FnBP和clfA的表达分析

为探究致奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的生物学特性,对新疆垦区部分奶牛场乳房炎奶样进行病原学分析,并对病原菌进行耐药性、毒力因子的表达分析。从乳房炎奶样中分离得到S.aureus,采用血浆凝固酶试验、KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法(VITEK32)、聚合酶链式反应等法进行鉴定。针对毒力基因clfA(凝集因子A)和FnBP(纤维结合素结合蛋白)进行特异性PCR扩增,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体,并构建原核表达载体pET-28a(+)-FnBP和pET-28a(+)-clfA。转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。常规鉴定出葡萄球菌105株,其中金黄色葡萄球菌(S.aureus)62株,从62株S.aureus中检出耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)13株,检出率为20.10%,2株未确检。经测序证实与GenBank中FnBP基因(J04151)和clfA基因(AB245457)序列同源性分别为100%和95.69%。SDS-PAGE显示,clfA和FnBP蛋白相对分子质量分别为45ku和58ku。Western blot分析显示,clfA蛋白和FnBP蛋白均可与金黄色葡萄球菌多克隆抗血清发生特异性反应。病畜奶样中MRSA检出率较高,新疆垦区部分牛场呈蔓延趋势,成功表达了clfA、FnBP蛋白,具有一定的免疫保护效果。     

重组腺病毒介导的猪瘟 E0基因在山羊乳腺中的表达

为使猪温病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌,一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFVE0基因通过腺病毒穿梭载体被插入到腺病毒质粒中,将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0。为证明其有效性,用Ad-hisE0感染293A细胞,实时定量PCR检测显示E0基因的表达显著提高。用Ad-hisE0分别感染牛乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺,SDS-PAGE和Western blot分析结果显示出E0蛋白分别位于26ku和48ku处的2条特异性条带。证实构建的腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。     

山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、 序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的GTPV基因组序列,设计并合成1对特异性引物,以GTPV疫苗株基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF103基因片段并进行序列分析,再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-ORF103,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDSPAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35ku的重组蛋白,该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料,并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。     

麦洼牦牛 Hoxa10基因克隆、原核表达及组织表达谱

从麦洼牦牛肾脏组织提取总RNA，以已公布牛 Hoxa10编码区序列设计引物，RT PCR法克隆麦洼牦牛 Hoxa10基因；构建原核表达载体pET 32a(+) Hoxa10，并在大肠杆菌表达系统中表达，SDS PAGE检测融合蛋白；采用RT PCR检测该基因在麦洼牦牛各组织中的表达分布。结果表明：从麦洼牦牛肾脏中克隆 Hoxa10基因的CDs区，大小为285 bp，编码94个氨基酸残基，与牛、猪和绵羊的 Hoxa10同源性高；经IPTG诱导，pET 32a(+) Hoxa10在BL21中可表达1个大小约为28 ku的特异蛋白；在牦牛各组织中，肾脏和肺脏中表达较高，但在心脏表达量极低或不表达。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

链球菌GapC基因重组痘苗病毒的构建及筛选与鉴定

为了研制链球菌性奶牛乳房炎的有效疫苗,首先用PCR方法扩增出停乳链球菌的GapC基因。其次将GapC基因连接到pSC11穿梭质粒上,构建pSC11-GapC重组穿梭质粒。然后在脂质体的介导下将pSC11-GapC转染已感染痘苗病毒的BHK-21细胞,使之与痘苗病毒基因在BHK-21细胞内进行同源重组,得到GapC重组痘苗病毒,用rVV-GapC表示。最后用蓝斑法连续筛选5次rVV-GapC重组毒,再用PCR和Western blot分别检测rVV-GapC的重组和表达情况。结果显示,PCR电泳检测到目的条带,测序结果与GenBank公布的标准序列同源性99%,Western blot试验证明GapC蛋白在重组毒中进行了表达。rVV-GapC构建成功。重组痘苗病毒的构建为链球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究奠定基础。     

玉米特异表达启动子驱动下结核esat-6抗原基因植物表达载体的构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Esat-6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,将globulin-1-Esat6联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中,构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GEsat-6,电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.通过对pC1300GEsat-6质粒酶切鉴定和测序分析表明克隆的Esat-6与预期相符,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.